專利名稱：：Ⅰ、ⅱ型單純皰疹病毒熒光定量pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速定量檢測不同基因分型單純皰疹病毒I、II(herpessimplexvirus,HSVI、II)型血清DNA的熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒在我國亦為常見性傳播病之一，本病發(fā)病率高，可通過胎盤及產(chǎn)道感染新生兒，導(dǎo)致流產(chǎn)及新生兒死亡，與宮頸癌的發(fā)生也有關(guān)，危害較大，又無特效療法，已受到人們的重視。在國外，生殖器皰疹的發(fā)病率在性病中僅次于淋病和梅毒，居性病發(fā)病率的第三位，在由病毒所引起的性傳播疾病中占第一位。單纟屯皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)屬于皰疹病毒科(herpesviridae)。皰疹病毒科是一群中等大小的雙鏈DNA病毒，有10()個以上成員，根據(jù)理化性質(zhì)分為(x、卩、y三個皰疹病毒亞科。皰疹病毒感染的宿主范圍極為廣泛，可感染人類和其他脊椎動物，包括哺乳類、魚類、兩棲類、鳥類、有袋類等。皰疹病毒主要侵犯外胚層來源的組織，包括皮膚、粘膜和神經(jīng)組織.皰疹病毒感染部位和引起的疾病多種多樣，并有潛伏的趨向，嚴(yán)重威脅人類健康。單純皰疹病毒可分為I型和II型二種，I型皰疹病主要是通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸傳播，感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官。如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹，口和口周圍發(fā)生的皰疹，99%是由1型皰疹病毒感染引起的。II型皰疹病毒主要存在于女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處，是引起生殖器發(fā)炎和皰疹的罪魁禍?zhǔn)?。?jù)有關(guān)統(tǒng)計資料顯示，生殖器皰疹的病原體9()%為11型皰疹病毒，僅1()%為I型皰疹病毒。用熒光探針定量PCR技術(shù)檢測HSV-DNA的意義(-)雖然分離培養(yǎng)法是檢測ibv的金標(biāo)法，但其有費時、繁瑣的缺點。臨床上常用的elisa和間接免疫熒光法(ifa)來檢測hsv特異性抗體，但在在疾病早期(即病毒"窗口期")血液中不易檢測到病毒抗體，此時，宜首選熒光探針定量pcr法進(jìn)行檢測。研究證實，在生殖器潰瘍愈合過程中，熒光探針定量pcr檢測無癥狀排毒更為敏感。因此，對于皰疹已結(jié)痂者，或無痂狀排毒的患者，用熒光探針定量pcr法檢測單純皰疹病毒可作為首選方法。(二)對處于育齡期的女性患者來說，hsv的感染應(yīng)引起高度重視，以免因hsv感染而導(dǎo)致胎兒畸形的可能性發(fā)生。由于hsv感染與宮頸癌關(guān)系密切，曾經(jīng)感染或己經(jīng)感染有生殖器皰疹的婦女，應(yīng)特別警惕生殖器皰疹感染引發(fā)的宮頸癌變。因此，熒光探針定量pcr檢測對早期篩查hsv感染、預(yù)防宮頸癌的發(fā)生有十分重要的意義。(二)對臨床上由hsv-i型或hsv-ii型感染所致的皰疹性角膜炎、咽炎、腦膜炎、生殖器各類皰疹、宮頸癌、先天性及新生兒感染、胎兒畸形等各種疾病，特異、敏感、快速、方便的pcr技術(shù)對其原發(fā)感染或潛伏感染，可先于免疫學(xué)抗體出現(xiàn)前做出hsv感染的早期診斷。(四)通用型可以檢測hsv-i或hsv-ii的感染。(五)可以用于考核療效與預(yù)后，并可進(jìn)行hsv分子病毒學(xué)及流行病學(xué)研究。hsv感染經(jīng)治愈后，其熒光探針pcr法檢測hsv-dna呈陰性，而這時抗體檢測仍可為陽忭結(jié)果。在過去十年中，由于分子生物技術(shù)的引入，使單純皰疹病毒的研究在分子水平上取得了突破性的進(jìn)展，單純皰疹病毒i、ii型(hsv-i、n)基因組的全序列已經(jīng)基本弄清，利用核酸pcr技術(shù)檢測hsv已成為臨床檢驗的發(fā)展方向。本發(fā)明即利用熒光定量pcr技術(shù)對單純皰疹病毒進(jìn)行檢測，具有特異性好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，BJ-重復(fù)性高等特點，可進(jìn)行快速定性定量檢
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種精確簡便的用于定量單純皰疹病毒i、n型的方法；本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。基于上述tl的，本發(fā)明采用以—F技術(shù)方案本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)分析所有已報道的單純皰疹病毒I、II型的基因組序列，選擇了一組高度保守的基因序列，并分別設(shè)計引物和熒光探針。在常規(guī)PCR檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，添加一條標(biāo)記了兩個熒光基團(tuán)的核苷酸探針，熒光報告基團(tuán)(R)標(biāo)記在探針的5'端，熒光淬滅基團(tuán)(Q)標(biāo)記在3'端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即熒光報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光可被熒光淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)—者距離變遠(yuǎn)時，抑制作用減弱，報告基團(tuán)熒光信號增強。在擴(kuò)增反應(yīng)過程屮，Taq酶的5'端外切酶活性將特異性結(jié)合在目的擴(kuò)增片斷上的熒光探針酶切降解，熒光淬滅基團(tuán)(Q)的抑制作用消失，報告基團(tuán)熒光信號增強，從而進(jìn)行單純皰疹病毒I、II型的檢測。本發(fā)明的優(yōu)點1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達(dá)1000copies/ml，說明其具有良好的靈敏度。2)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有單純皰疹病毒的檢測樣本均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性。3)由于本發(fā)明采用單純皰疹病毒I、n型的DNA聚合酶高度保守基因作為擴(kuò)增的il的基因，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。4)由于本發(fā)明采用了熒光定量PCR技術(shù)作為檢測方法，整個反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其他核酸檢測方法如PCR—電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結(jié)果；由于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。本發(fā)明提供了用于單純皰疹病毒I、II型檢測的實時熒光PCR引物對及探針。其中所述的特異性地針對其DNA聚合酶高度保守基因的引物對和探針的核苷酸序列為引物序列為正向引物P1:5'—ACGTCTTTTCGCACTCGA—3，，正向引物的反向互補序列為5，一TCGAGTGCGAAAAGACGT—3，；反向引物P2:5，-TGGAGGTGCGGTTGATAA—3'，反向引物的反向互補序列為5'—TTATCAACCGCACCTCCA—3';以及該引物對的上游引物向5，端延伸10個堿基、下游引物向3'端延伸IO個堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物及互補序列；熒光探針序列為5，一ACCAGATCCACGCCCTTGA—3，，探針的反向互補序列為5，一TCAAGGGCGTGGATCTGGT—3',以及該探針向5，端延伸10個堿基、向3，端延伸l()個堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列及互補序列。單純皰疹病毒I、II型PCR通用引物和探針設(shè)計完成后，采用在先BLAST分析其序列的特異性，結(jié)果表明此通用引物和探針設(shè)計區(qū)域為單純皰疹病毒I、II型所特有的，沒有發(fā)現(xiàn)同源序列或序列一致性生物基因信息，可以保證擴(kuò)增所述的熒光探針的5'端用報告熒光染料標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料標(biāo)記。可用于本發(fā)明的報告熒光染料包括但不限于，例如，F(xiàn)AM、JOE和1-正X?？捎糜诒景l(fā)明的報告熒光染料包括但不限于,例如，Eclips和TAMTRA。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，引物的擴(kuò)增長度為141bp，探針設(shè)計于待擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)，5'端標(biāo)記報告熒光染料為FAM，3'端標(biāo)記的淬滅熒光染料為TAMRA。在利用本發(fā)明所述方法對待測樣本進(jìn)行檢測時，可直接取~-定量的本發(fā)明試齊U，按照確立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測并判定結(jié)果。具體實施例方式1.引物和探針設(shè)計通過分別對所有已知的單純皰疹病毒基因組序列及進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段(單純皰疹病毒I、II型的DNA聚合酶高度保守基因，其序列見附錄)，設(shè)計多對引物和探針，弓l物長度一般為2()個堿基左右，引物間和引物內(nèi)盡量避免有互補序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下正向引物P1:5，-—ACGTCTTTTCGCACTCGA—3，反向引物P2:5,—TGGAGGTGCGGTTGATAA—3，熒光探針序列為5，一ACCAGATCCACGCCCTTGA—3，2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化反應(yīng)體系得建立和優(yōu)化中所采用的耙區(qū)域模板以如.F方法獲得利用臨床待檢單純皰疹病毒樣本作為待檢樣品，利用堿熱裂解法的方法提取單純皰疹病毒DNA。2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他條件相同的情況下，將HSV的引物濃度分別從O.1umol/L至l.0umol/L做倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳的引物終濃度為0.2umol/L。2.2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他條件相同的情況下，將HSV的探針濃度分別從O.1"mol/L至0.5umol/L做倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳的引物終濃度為O.2umol/L。2.3鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系屮其他條件不變的前提下，將鎂離子濃度從l.0mmol/L至4ramol/L以0.5咖ol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗結(jié)果分析比較，確定最佳的鎂離子濃度為2.5mmol/L。2.4TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位U計)的優(yōu)化試驗結(jié)果，選定2U為最佳Taq酶用量。2.5dNTPs濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中，將dNTPs濃度從O.lmmol/L至1咖K)1/L以0.l腿ol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗結(jié)果分析比較，確定最佳的(iNTPs濃度為O.3mmol/L。利用上述引物、探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光定量PCR反應(yīng)體系為50uL，所需各組分及相應(yīng)濃度見表l。表l優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注1)在熒光PCR反應(yīng)體積不同時，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整;2)使用的儀器不同時，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。3.儀器檢測通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時，應(yīng)對所用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。4.PCR反應(yīng)條件如下93°C—2分鐘，l個循環(huán)93°C40秒一56°C45秒，10個循環(huán)93°C30秒一55°C40秒，30個循環(huán)。(采集熒光信號)5.檢測步驟5.1選取引物和探針；5.2制備待測模板，可采用堿熱裂解方法提取單純皰疹病毒DNA;5.3反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定最佳探針濃度；C、確定最佳鎂離子濃度；d、確定最佳TaQ使用量；e、確定最佳dNTPs濃度；5.4選擇儀器的檢測方式5.5上機檢測。實施例l-…1、II型單純皰疹病毒熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒選取引物對探針，將待檢的單純皰疹病毒減毒株培養(yǎng)物用堿熱裂解方法提取基因組DNA。具體步驟如下1)標(biāo)本試管中加入lml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻；2)吸取液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管，12，000rpm離心5分鐘再重復(fù)一次；3)沉淀直接加40ul核酸提取液(DNA)充分混勻(提取液用前需室溫溶解并充分混勻)；4)沸水浴10分鐘，轉(zhuǎn)至4。C靜置5分鐘；5)12，000rpm離心3分鐘；6.)取上清液2ul做PCR反應(yīng)。在50ix1熒光PCR反應(yīng)體系中，加入以上提取的單純皰疹病毒基因組DNA2ul，根據(jù)前述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢須ij。經(jīng)檢測，若待測培養(yǎng)物中含有單純皰疹病毒則顯示陽性擴(kuò)增曲線(見圖l)，其檢測靈敏度可達(dá)lXl()、opies/ml。若待檢樣本中不含單純皰疹病毒則無擴(kuò)增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度及特異性(靈敏度試驗結(jié)果見圖2、3，特異性試驗結(jié)果見圖4)。實施例2---臨床檢測用上述方法對115例臨床樣本進(jìn)行檢測，其中單純皰疹患者42例，檢出陽性率99%，準(zhǔn)確率98.6%，并且能夠?qū)渭儼捳畈《綢、n型進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，可重復(fù)性高，可對單純皰疹病毒進(jìn)行快速定量檢測。此外，單純皰疹病毒I、II型熒光定量PCR檢測方法降低了臨床樣品PCR診斷的工作量和診斷的成本，具有潛在的應(yīng)用價值。圖1是單純皰疹病毒陽性擴(kuò)增曲線圖圖2是靈敏度試驗結(jié)果圖圖3是靈敏度試驗結(jié)果圖圖4是特異性試驗結(jié)果圖附錄單純皰疹病毒I型DNA酶高度保守基因序列1ATGTTTTCCGGTGGCGGCGGCCCGCTGTCCCCCGGAGGAAAGTCGGCGGCCAGGGCGGCG61TCCGGGTTTTTTGCGCCCGCCGGCCCTCGCGGAGCCGGCCGGGGACCCCCGCCTTGTTTG121AGGCAAAACTTTTACAACCCCTACCTCGCCCCAGTCGGGACGCAACAGAAGCCGACCGGG'181CCAACCCAGCGCCATACGTACTATAGCGAATGCGATGAATTTCGATTCATCGCCCCGCGG241GTGCTGGACGAGGATGCCCCCCCGGAGAAGCGCGCCGGGGTGCACGACGGTCACCTCAAG301CGCG(XCCCAAGGTGTACTGCGGGGGGGACGAGCGCGACGTCCTCCGCGTCGGGTCGGGC3'61GGCTTCTGGCCGCGGCGCTCGCGCCTGTGGGGCGGCGTGGACCACGCCCCGGCGGGGTTC421A.ACCCCACCGTCACCGTCTTTCACGTGTATGACATCCTGGAGMCGTGGAGCACGCGTAC481GGCATGCGCGCGGCACAGTTCCACGCGCGGTTTATGGACGCCATCACACCGACGGGGACC541GTCGTCACGCTCCTGGGCCTGACTCCGGAAGGCCACCGGGTGGCCGTTCACGTTTACGGC601ACGCGGCAGTACTTTTACATGAACAAGGAGGAGGTTGACAGGCACCTACAATGCCGCGCC661CCACGAGATCTCTGCGAGCGCGCGTCGTTC721CGCGGCATCTCCGCGGACCACGTGTACTAC781TACGAGACGCGCCCCGCTCTCGTGCTGTCG841TACCTGTGCGACAACTTCTGCGACGCCACC901ACCCGGTTCATCCTGGACAATCTCAAACCG961GGCCGGAACAACACGCTAGCATCCAGCGAC1021GTCGAGTTTAACTGTACGGCCGACCTACCG1081GCATACAAGCTCATGTGCTTCGAGCTGGCC1141TTTCCGGTGGCCGGGCACCCGCTCTACGAC1201CTGTCTACCACCGCCCTGGACGACCTCCCC1261GAATCCCACCTGAACGAGCTTCTGGAATTCCATGGCCGCGGCCCTGCGCGAGTCCCCGGGCTTCGAGGCGGAGGTGGTGGAGCGCACCGAGTTTTACCGCGTCTACGTCCGAAGCGGGCGCCCGGCCATCAAGAAGTACGAGGGTGGGGTCCCCGGGTTCGTCACCTTCGGCTGGTACCGCCAGCCGCGGGCCCCTATGGCCTTCGGGACGGACAACCTGGCCATCGAGGGGGGCATGAGCGATATCGAATGCAAGGCGGGGGGGGAGGAGGAGGACCTGGTCATCCAGATATCCTGTCTGCACGTCCTCCTGTTTTCGCTCGGTTCCTGGGCGGCCAGGGGCCTGCCCACGCCCGTGGT131321GACAGCGAATTCGAGATGCTGTTGGCCTTCATGACCCTTGTGMACAGTACGGCCCCGAG1381TTCGTGACCGGGTACAACATCATCAACTTCGACTGGCCCTTCTTGCTGGCCAAGCTGACG1441GACATTTACAAGGTCCCCCTGGACGGGTACGGCCGCATGAACGGCCGGGGCGTGTTTCGC1501GTGTGGGACATAGGCCAGAGCCACTTCCAGAAGCGCAGCAAGATAAAGGTGAACGGCATG1561GTGAACATCGACATGTACGGGATTATAACCGACAAGATCAAACTCTCGAGCTACAAGCTC1621AACGCCGTGGCCGAAGCCGTCCTGA.AGGACAAGAAGAAGGACCTGAGCTATCGCGACATC1681CCCGCCTACTACGCCGCCGGGCCCGCGCAACGCGGGGTGATCGGCGAGTACTGCATACAG1741GATTCCCTGCTGGTGGGCCAGCTGTTTTTTAAGTTTTTGCCCCATCTGGAGCTCTCGGCC1801GTCGCGCGCTTGGCGGGTATTAACATCACCCGCACCATCTACGACGGCCAGCAGATCCGC1861GTCTTTACGTGCCTGCTGCGCCTGGCCGACCAGAAGGGCTTTATTCTGCCGGACACCCAG1921GGGCGATTTAGGGGCGCCGGGGGGGAGGCGCCCAAGCGTCCGGCCGCAGCCCGGGAGGAC1981GAGGAGCGGCCAGAGGAGGAGGGGGAGGACGAGGACGAACGCGAGGAGGGCGGGGGCGAG2041CGGGAGCCGGAGGGCGCGCGGGGGGCCAGG2101GTCCTTGACCCCACTTCCGGCTTTGCCAGC2161CTGTACCCCAGCATCATCCACCTGAGGGCC2221GACGCAGTGGCGCACCTGGAGGGGGGGCGA2281CGGCTGTTCTTCGTCAAGGCCCTGCGGGAC2341TGGCTCGCCATGCGAAAGCACGAGGAGGCC2401GTGCTCCTGGACAAGCAGCAGTACGGGTTC2461ACGGGAGTGCAGCACGGACTGACGACCATC2521GGCCGCGAGATGCTGCTCGCGGCCTTCGAA2581CAGCTCCTGGCCGATTTCCCCTATTCCATG2641CGCATCATCTACGGGGACACCACGGCCGCCGGAGACCGCCGGCCGGCACGTGGGGTACCAGTTTCACGTGAACCCCGTGGTGGTGTTCGAGGCCCACAACCTGTGCTTCAGCACGCTCTCGGCGGGCAAGGACTACCTGGAGATCGAGGTTCACGTGCGAGAGAGCCTCCTCAGCATCCTGATCCGCTCGCGGATTCCCCAGAGCAGCCCGGCCGCCATCAAGGTCGTGTGTAACTCGGTCCTGCCGTGCCTGCACGTTGCCGCGACGGTGACCCGCGAGTACGTCCACGCGCGCTGGGCGGAGGCGGCCGACATGCGCGCCCCCGGGCCGGACTCCATATTTGTGCTGTGCCGCGGCCT2701GGGCTGACGGCCATGGGCGACAAGATGGCGAGCCACATCTCGCGCGCGCTGTTTCTGCCC2761CCCATCA.AACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCACCAAGCTGCTGCTGATCGCCAAGAAAAAG2821TACATCGGCGTCATCTACGGGGGTAAGATGCTCATCAAGGGCGTGGATCTGGTGCGCAAA2881AACAACTGCGCGTTTATCAACCGCACCTCCAGGGCCCTGGTCGACCTGCTGTTTTACGAC2941GATACCGTATCCGGAGCGGCCGCCGCGTTAGCCGAGCGCCCCGCAGAGGAGTGGCTGGCG3.001CGACCCCTGCCCGAGGGACTGCAGGCGTTCGGGGCCGTCCTCGTAGACGCCCATCGGCGC3061ATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTTTGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACAC3121CCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCTGGCCCACCTGACAGTGTATTACAAGCTCATGGCC3181CGCCGCGCGCAGGTCCCGTCCATCAAGGACCGGATCCCGTACGTGATCGTGGCCCAGACC3241CGCGAGGTAGAGGAGACGGTCGCGCGGCTGGCCGCCCTCCGCGAGCTAGACGCCGCCGCC3301CCAGGGGACGAGCCCGCCCCCCCCGCGGCCCTGCCCTCCCCGGCCAAGCGCCCCCGGGAG3361ACGCCGTCGCATGCCGACCCCCCGGGAGGCGCGTCCAAGCCCCGCAAGCT16GCTGGTGTCC3421GAGCTGGCCGAGGATCCCGCATACGCCATTGCCCACGGCGTCGCCCTGAACACGGACTAT3481TACTTCTCCCACCTGTTGGGGGCGGCGTGCGTGACATTCAAGGCCCTGTTTCGGAATAAC3541GCCAAGATCACCGAGAGTCTGTTAMAAGGTTTATTCCCGAAGTGTGGCACC(XCCGGAC3601GACGTGGCCGCGCGGCTCCGGGCCGCAGGGTTCGGGGCGGTGGGTGCCGG.CGCTACGGCG3661GAGGAAACTCGTCGAATGTTGCATAGAGCCTTTGATACTCTAGCATGA單純皰疹病毒II型DNA酶高度保守基因序列1ATGTTTTCCGGTGGCGGCGGCCCGCTGTCCCCCGGAGGMAGTCGGCGGCCAGGGCGGCG61TCCGGGTTTTTTGCGCCCGCCGGCCCTCGCGGAGCCGGCCGGGGACCCCCGCCTTGTTTG121AGGCAAAACTTTTACAACCCCTACCTCGCCCCAGTCGGGACGCAACAGAAGCCGACCGGG181CCAACCCAGCGCCATACGTACTATAGCGAATGCGATGAATTTCGATTCATCGCCCCGCGG241GTGCTGGACGAGGATGCCCCCCCGGAGAAGCGCGCCGGGGTGCACGACGGTCACCTCAAG301CGCGCCCCCAAGGTGTACTGCGGGGGGGACGAGCGCGACGTCCTCCGCGTCGGGTCGGGC200810222655.8361GGCTTCTGGCCGCGGCGCTCGCGCCTGTGGGGCGGCGTGGACCACGCCCCGGCGGGGTTC421AACCCCACCGTCACCGTCTTTCACGTGTATGACATCCTGGAGAACGTGGAGCACGCGTAC481GGCATGCGCGCGGCACAGTTCCACGCGCGGTTTATGGACGCCATCACACCGACGGGGACC541GTCGTCACGCTCCTGGGCCTGACTCCGGAAGGCCACCGGGTGGCCGTTCACGTTTACGGC601ACGCGGCAGTACTTTTACATGAACAAGGAGGAGGTTGACAGGCACCTACAATGCCGCGCC661CCACGAGATCTCTGCGAGCGCATGGCCGCGGCCCTGCGCGAGTCCCCGGGCGCGTCGTTC721CGCGGCATCTCCGCGGACCACTTCGAGGCGGAGGTGGTGGAGCGCACCGACGTGTACTAC781TACGAGACGCGCCCCGCTCTGTTTTACCGCGTCTACGTCCGAAGCGGGCGCGTGCTGTCG841TACCTGTGCGACAACTTCTGCCCGGCCATCAAGAAGTACGAGGGTGGGGTCGACGCCACC901ACCCGGTTCATCCTGGACAACCCCGGGTTCGTCACCTTCGGCTGGTACCGTCTCAAACCG961GGCCGGAACAACACGCTAGCCCAGCCGCGGGCCCCTATGGCCTTCGGGACATCCAGCGAC1021GTCGAGTTTAACTGTACGGCGGACAACCTGGCCATCGAGGGGGGCATGAGCGACCTACCG1081GCATACAAGCTCATGTGCTTCGAGCTGGCC1141TTTCCGGTGGCCGGGCACCCGCTCTACGAC1201CTGTCTACCACCGCCCTGGACGACCTCCCC1261GAATCCCACCTGAACGAGCTTCTGGAATTC1321GACAGCGAATTCGAGATGCTCGGCCCCGAG1381TTCGTGACCGGGTACAACATCAAGCTGACG1441GACATTTACAAGGTCCCCCTCGTGTTTCGC1501GTGTGGGACATAGGCCAGAGGAACGGCATG1561GTGAACATCGACATGTACGGCTACAAGCTC1621AACGCCGTGGCCGAAGCCGTTCGCGACATC1681CCCGCCTACTACGCCGCCGGCTGCATACAGCGATATCGAATGCAAGGCGGGGGGGGAGGAGGAGGACCTGGTCATCCAGATATCCTGTCTGCACGTCCTCCTGTTTTCGCTCGGTTCCTGGGCGGCCAGGGGCCTGCCCACGCCCGTGGTGTTGGCCTTCATGACCCTTGTGAAACAGTACATCAACTTCGACTGGCCCTTCTTGCTGGCGGACGGGTACGGCCGCATGAACGGCCGGGGCCACTTCCAGAAGCGCAGCAAGATMAGGTGATTATAACCGACAAGATCAAACTCTCGAGCCTGAAGGACAAGAAGAAGGACCTGAGCTAGCCCGCGCAACGCGGGGTGATCGGCGAGTA1741GATTCCCTGCTGGTGGGCCAGCTGTTTTTTAAGTTTTTGCCCCATCTGGAGCTCTCGGCC1801GTCGCGCGCTTGGCGGGTATTAACATCACCCGCACCATCTACGACGGCCAGCAGATCCGC1861GTCTTTACGTGCCTGCTGCGCCTGGCCGACCAGAAGGGCTTTATTCTGCCGGACACCCAG1921GGGCGATTTAGGGGCGCCGGGGGGGAGGCGCCCAAGCGTCCGGCCGCAGCCCGGGAGGAC1981GAGGAGCGGCCAGAGGAGGAGGGGGAGGACGAGGACGAACGCGAGGAGGGCGGGGGCGAG2041CGGGAGCCGGAGGGCGCGCGGGAGACCGCCGGCCGGCACGTGGGGTACCAGGGGGCCAGG2101GTCCTTGACCCCACTTCCGGGTTTCACGTGAACCCCGTGGTGGTGTTCGACTTTGCCAGC2161CTGTACCCCAGCATCATCCAGGCCCACAACCTGTGCTTCAGCACGCTCTCCCTGAGGGCC2221GACGCAGTGGCGCACCTGGAGGCGGGCAAGGACTACCTGGAGATCGAGGTGGGGGGGCGA2281CGGCTGTTCTTCGTCAAGGCTCACGTGCGAGAGAGCCTCCTCAGCATCCTCCTGCGGGAC2341TGGCTCGCCATGCGAAAGCAGATCCGCTCGCGGATTCCCCAGAGCAGCCCCGAGGAGGCC2401GTGCTCCTGGACAAGCAGCAGGCCGCCATCAAGGTCGTGTGTAACTCGGT20GTACGGGTTC2461ACGGGAGTGCAGCACGGACTGACGACCATC2521GGCCGCGAGATGCTGCTCGCGGCCTTCGAA2581CAGCTCCTGGCCGATTTCCCCTATTCCATG2641CGCATCATCTACGGGGACACCACGGCCGCC2701GGGCTGACGGCCATGGGCGAGTTTCTGCCC2761CCCATCAAACTCGAGTGCGACAAGAAAAAG2821TACATCGGCGTCATCTACGGGGTGCGCAM2881AACAACTGCGCGTTTATCAAGTTTTACGAC2941GATACCGTATCCGGAGCGGCGTGGCTGGCG3001CGACCCCTGCCCGAGGGACTCCATCGGCGC3061ATCACCGACCCGGAGAGGGAG'AGCAGACACCCTGCCGTGCCTGCACGTTGCCGCGACGGTGACCCGCGAGTACGTCCACGCGCGCTGGGCGGAGGCGGCCGACATGCGCGCCCCCGGGCCGGACTCCATATTTGTGCTGTGCCGCGGCCTCAAGATGGCGAGCCACATCTCGCGCGCGCTAAAGACGTTCACCAAGCTGCTGCTGATCGCGGGTAAGATGCTCATCAAGGGCGTGGATCTCCGCACCTCCAGGGCCCTGGTCGACCTGCTCGCCGCGTTAGCCGAGCGCCCCGCAGAGGAGCAGGCGTTCGGGGCCGTCCTCGTAGACGCCATCCAGGACTTTGTCCTCACCGCCGAACT3121CCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCTGGCCCACCTGACAGTGTATTACAAGCTCATGGCC3181CGCCGCGCGCAGGTCCCGTCCATCA.AGGACCGGATCCCGTACGTGATCGTGGCCCAGACC3241CGCGAGGTAGAGGAGACGGTCGCGCGGCTGGCCGCCCTCCGCGAGCTAGACGCCGCCGCC3301CCAGGGGACGAGCCCGCCCCCCCCGCGGCCCTGCCCTCCCCGGCCAAGCGCCCCCGGGAG3361ACGCCGTCGCATGCCGACCCCCCGGGAGGCGCGTCCAAGCCCCGCAAGCTGCTGGTGTCC3421GAGCTGGCCGAGGATCCCGCATACGCCATTGCCCACGGCGTCGCCCTGAACACGGACTAT3481TACTTCTCCCACCTGTTGGGGGCGGCGTGCGTGACATTCAAGGCCCTGTTTGGGAATAAC3541GCCAAGATCACCGAGAGTCTGTTAAAAAGGTTTATTCCCGAAGTGTGGCACCCCCCGGAC3601GACGTGGCCGCGCGGCTCCGGGCCGCAGGGTTCGGGGCGGTGGGTGCCGGCGCTACGGCG3661GAGGAAACTCGTCGAATGTTGCATAGAGCCTTTGATACTCTAGCATGA引物對擴(kuò)增目的片段單純皰疹病毒I型27712911TCGAGTGCGAAAAGACGTTCACCAAGCTGCTGCTGATCGCCAAGAAAAAGTACATCGGCGTCATCTACGGGGGTAAGATGCTCATCAAGGGCGTGGATCTGGTGCGCAAAAACAACTGCGCGTTTATCAACCGCACCTCCA單純皰疹病毒II型27862926TCGAGTGCGAAAAAACGTTCACCAAGCTGCTGCTCATCGCCAAGMAAAGTACATCGGCGTCATCTGCGGGGGCAAGATGCTCATCAAGGGCGTGGATCTGGTGCGCAAAAACAACTGCGCGTTTATCAACCGCACCTCCA序列表<no〉揚子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司〈120〉I、II型單純皰疹病毒熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒〈160〉3〈170〉Patent工nversion3.3<210>1〈211〉18〈212〉麵〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)..(18)〈400〉1acgtc1111cg.ca.ctcga2418〈210〉2〈211〉18〈212〉腿〈213>人工序列〈220>〈221〉misc——feature〈222〉(1)..(18)〈400〉2tggaggtgcggttgataa18〈210〉3〈2丄1〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈■221〉misc——feature〈222〉(1).(19)〈223〉5'端連有熒光基團(tuán)FAM，3，端連有淬滅基團(tuán)TAMRA〈■〉3acc卿tccacgcccttga19權(quán)利要求1.用于I、II型單純皰疹病毒熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒和實時熒光PCR的引物對及探針。2.權(quán)利要求1所述的引物對及探針，其中所述引物對的序列為正向引物P1:5，—-ACGTCTTTTCGCACTCGA—3'反向引物P2:5，一TGGAGGTGCGGTTGATAA—3，熒光探針序列為5，一ACCAGATCCACGCCCTTGA—3，該探針的5'端用報告熒光染料標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料標(biāo)記。3.權(quán)利要求2所述的引物對及探針，其中所述的報告熒光染料選自FAM、JOE和I-IEX。4.權(quán)利要求3所述的引物對及探針，其中所述的報告熒光染料為FAM。5.權(quán)利要求2所述的引物對及探針，其中所述的淬滅熒光染料選自Eclipse和TAMRA。6.權(quán)利要求5所述的引物對及探針，其中所述的淬滅熒光染料為TAMRA。7.—種用于檢測單純皰疹病毒I、II型的實時熒光PCR檢測方法，該方法包括T列歩驟1)使用權(quán)利要求l一-6中任一項所述的引物對及探針，與PCR擴(kuò)增用的PCR緩沖液及DNA聚合酶混合，得到檢測PCR反應(yīng)液；2)向t述PCR反應(yīng)液中加入提取的待檢樣本的基因組DNA;3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)設(shè)置對應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)循環(huán)數(shù)，依據(jù)建立的判定標(biāo)準(zhǔn)對待測樣本進(jìn)行定性分析，判定樣本中是否含有單純皰疹病毒。8.權(quán)利要求7所述方法，其中所述的判定標(biāo)準(zhǔn)為如果待測樣本的Ct值〈27，判定為陽性；若27<0,值<30，則建議重新對樣本進(jìn)行檢測，若樣本仍Ct值<30，則判定為陽性，否則為陰性；若Ct二30，則判定為陰性。全文摘要本發(fā)明涉及針對I、II型單純皰疹病毒熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明針對DNA酶高度保守區(qū)設(shè)計引物進(jìn)行PCR，同時在擴(kuò)增序列中間設(shè)計了熒光探針，通過對反應(yīng)的退火溫度和引物、探針、鎂離子等濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了單純皰疹病毒I、II型實時熒光PCR的檢測方法。本發(fā)明的試劑盒在保證靈敏度、準(zhǔn)確度的情況下，操作簡單、快速，降低了臨床檢測的勞動強度，同時降低了臨床PCR診斷的成本，延續(xù)了熒光定量PCR檢測方法的快速簡便性能。此方法可用于I、II型單純皰疹病毒定量檢測，具有實際的臨床應(yīng)用價值。文檔編號C12Q1/68GK101676409SQ20081022265公開日2010年3月24日申請日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日發(fā)明者唐先兵,李曉雯,石和鵬,靜肖,鄭宜婷申請人:揚子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司