一種用于競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)的固相抗體預(yù)包被方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)的預(yù)包被固相抗體的方法。本發(fā)明用包被緩沖液將羊抗兔等第二抗體配制成合適濃度，加入96孔不透明微孔板中進行物理吸附，完成后可棄去液體；再用封閉緩沖液稀釋抗體，加入微孔板中進行雙重包被，最后棄去液體并干燥，得到固相抗體包被板。該制備方法與單純包被抗體或第二抗體相比，具有抗體利用率提高，包被板活性增強的特點，可以提升預(yù)包被板的性能指標。
【專利說明】
一種用于競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)的固相抗體預(yù)包被方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于體外免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采取第二抗體與抗體雙重包被 制備預(yù)包被板的方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫反應(yīng)一般需要一種標記方案，一種分離方案。96孔微孔板上預(yù)包被固相抗體 是一種常規(guī)、經(jīng)濟、方便的分離方案。96孔微孔板用于化學(xué)發(fā)光試驗時，一般以辣根酶催化 魯米諾發(fā)光最為常用。96孔微孔板材質(zhì)為聚苯乙烯，其包被蛋白有兩種具體的操作辦法，一 種是直接物理吸附，即通過疏水作用將IgG分子吸咐于聚苯乙烯材質(zhì)上，包括將IgG分子進 行疏水預(yù)處理。第二種是共價結(jié)合，通過引入氨基、羧基等通過共價反應(yīng)將IgG結(jié)合在聚苯 乙烯板上，目的是提高吸附量。目前商品化的試劑以第一種為主。直接物理除了包被抗體 外，還有一種變通思路就是制備通用性預(yù)包被板如第二抗體板、親和素板、熒光素抗體板 等，在免疫反應(yīng)時將抗體作為一種反應(yīng)組份加入，這樣可以實現(xiàn)統(tǒng)一的預(yù)包被板，從而節(jié)約 研發(fā)周期及成本等。但同時采取第二抗體與抗體進行雙重包被則未見報道。
[0003] 化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)測定有多個免疫決定簇的分子時，一般用夾心法，即用包被抗 體與標記抗體來識別抗原的兩個決定簇，最后形成的三明治的固相抗體-抗原-標記抗體結(jié) 合物?？乖瓭舛扰c最終的發(fā)光強度呈正相關(guān)。化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)測定小分子時，一般用競爭 法，包括包被抗體+標記抗原的競爭法及包被抗原+標記抗體的競爭法，最終抗原濃度與發(fā) 光強度呈反相關(guān)。競爭法常引入第二抗體如包被二抗+抗體+標記抗原的競爭法以及包被 抗原+抗體+標記二抗的競爭法。
[0004] 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體的物理吸附是非特異性的，包被量除受蛋白質(zhì)的分子 量、等電點、濃度等的影響，還受限于空間位阻，理想情況下抗體的最大吸附量可達300~ 400ng IgG/cm2。如果將微孔板上先包被第二抗體，一方面，預(yù)包被第二抗體后，相當于將平 面結(jié)構(gòu)變?yōu)榱Ⅲw結(jié)構(gòu)，增加了表面積。同時每個第二抗體分子有兩個Fab端，可以結(jié)合兩個 抗體，這樣就增加了抗體包被容量。另一方面，抗體的Fc端朝向第二抗體，F(xiàn)ab端暴露在外 側(cè)，使得抗體可以更好地參與免疫反應(yīng)。其它帶來的好處還包括抗體無須進行專門純化，減 少純化過程的損失與損傷，從而節(jié)約成本;抗體與第二抗體的親和力大，反應(yīng)更完全，導(dǎo)致 抗體加入量相應(yīng)減少，也可以節(jié)約成本。
[0005] 雙重包被的模式在包被抗體的競爭法上應(yīng)用是成立的。在夾心法上，固相的第二 抗體會對標記抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，影響夾心法的反應(yīng)模式，即便包被與標記采取異源抗體， 交叉反應(yīng)也可以導(dǎo)致靈敏度下降，因此雙重包被在夾心法模式上應(yīng)用是受到限制的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的首要目的是為了在競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)中，提升固相抗體的活性。 另一目的，是為了降低抗體純化的要求，使得多克隆血清、單克隆腹水無須純化可以直接使 用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是在抗體包被之前增加一次第二抗 體的包被，并將抗體包被與封閉結(jié)合在一起，以不增加工藝復(fù)雜性。具體步驟，包括：
[0008] 1.包被:將第二抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為1.0~10μg/ml，加入96孔不透明 微孔板中，靜置孵育。體積為l〇〇yl~200yl，在溫度為2~37°C條件下，靜置時間為2~72小 時。
[0009] 2.封閉：棄去孔中液體，用封閉緩沖液將抗體稀釋至合適的濃度，加入微孔板中， 靜置孵育。體積為l〇〇yl~200yl，在溫度為2~37°C條件下，靜置時間為2~72小時。
[0010] 3.干燥密封:棄去孔中液體，室溫干燥后密封保存。
[0011] 作為優(yōu)選，包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液，pH為7.0~9.6，濃度為 0.01~0.05M〇
[0012] 作為優(yōu)選，封閉緩沖液為磷酸鹽緩沖液，PH為7 ? 0~7 ? 5，濃度為0 ? 01~0 ? 05M，含牛 血清白蛋白〇~2%，新生牛血清0~10%，鹿糖0~20%，海藻糖0~5%。
[0013] 本發(fā)明在傳統(tǒng)的抗體包被之前增加了一步第二抗體的包被，并將抗體包被與封閉 一步進行，最終得到的包被板的活性要明顯優(yōu)于常規(guī)的抗體包被板。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點是：用廉價的第二抗體先進行一次預(yù)包被，最終制 得的化學(xué)發(fā)光固相抗體的活性要明顯優(yōu)于常規(guī)包被。并且抗體不需要純化，減少了抗體純 化帶來的損傷與損失，最終可以減少經(jīng)濟成本。
【附圖說明】
[0015] 圖1是孕酮兩種包被板對比實驗圖
[0016] 圖2是睪酮兩種包被板對比實驗圖
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而 本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0018] 實施例1:孕酮單克隆抗體固相抗體預(yù)包被板的制備步驟：
[0019] a ?包被:將羊抗鼠IgG用0 ? 02M磷酸鹽緩沖液，pH7 ? 2，稀釋至10μg/ml，按每孔100yl 加入到微孔中，4°C包被24小時。
[0020] b.封閉：棄去包被液，將孕酮單隆抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液，PH7.2，稀釋至lyg/ ml，并加入1 % BSA，10 %蔗糖。按每孔100y 1加入到微孔中，4°C封閉24小時。
[0021 ] c.干燥:棄封閉液，拍干，在低濕度（10~30 % )的室內(nèi)吹干過夜。鋁箱袋密封包裝。 [0022] d.對照板（直接包被板）：制備方法為：將孕酮單隆抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液， pH7.2，稀釋至1 yg/m 1，按每孔10Oyl加入到微孔中，4°C包被24小時，棄去包被液，封閉液 (0.02M磷酸鹽緩沖液，pH7.2，1 %BSA，10%蔗糖），按每孔100y 1加入到微孔中，4°C封閉24小 時。同樣進行干燥，密封包裝。
[0023] e.兩種包被板進行對比實驗，同時帶上不同濃度的孕酮校準品，結(jié)果如下：
[0024] 表1:孕酮兩種包被板發(fā)光值(RLU)對比實驗結(jié)果
[0026]以發(fā)光值(RLU)與濃度(ng/ml)進行l(wèi)ogit-log擬合，擬合方程分別為：
[0027]直接包被:In (結(jié)合率/ (1 -結(jié)合率））=-1.671og(濃度)+0.89，r = -0.9994
[0028] 雙重包被：ln(結(jié)合率/(i-結(jié)合率））=-i.sn〇g(濃度)+0.89，r = -0.9962
[0029] 雙重包被的發(fā)光值RLU為直接包被的1.78倍，意味著固相抗體的活性或包被量的 增加。
[0030 ]實施例2:睪酬多克隆抗體預(yù)包被板的制備步驟：
[0031] a.包被:將驢抗兔IgG用0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.5，稀釋至10μg/ml，按每孔lOOiil 加入到微孔中，4°C包被24小時。
[0032] b.封閉：棄去包被液，將兔抗睪酮多克隆抗體用0.02M磷酸鹽緩沖液，pH7.2，稀釋 至1:10萬，并加入0.5%BSA，5%蔗糖。按每孔100yl加入到微孔中，4°C包被24小時。
[0033] c.干燥:棄包被液，在低濕度（10~30% )的室內(nèi)吹干過夜。鋁箱袋密封包裝。
[0034] d.對照板（固相二抗板）：制備方法為:將驢抗兔IgG用0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.5， 稀釋至10μg/ml，按每孔100y 1加入到微孔中，4 °C包被24小時，棄去包被液，封閉液(0.02M磷 酸鹽緩沖液，PH7.2，0.5 %BSA，5 %蔗糖），按每孔100y 1加入到微孔中，4°C封閉24小時。同樣 進行干燥，密封包裝。
[0035] e.兩種包被板進行對比實驗，同時帶上不同濃度的睪酮校準品，結(jié)果如下：
[0036] 表2:睪酮兩種包被板發(fā)光值(RLU)對比實驗結(jié)果
[0037]
[0038] 以發(fā)光值(RLU)與濃度(ng/ml)進行l(wèi)ogit-log擬合，擬合方程分別為：
[0039] 固相二抗板：ln(結(jié)合率/(I-結(jié)合率））=-2.21og(濃度)+0.85，r = -0.9857
[0040] 雙重包被板:ln(結(jié)合率/(I-結(jié)合率））=-1.881og(濃度)-0? 76，r = -0.9968
[0041]雙重包被的發(fā)光值RLU為直接包被的2.0倍，意味著固相抗體的活性或包被量的 增加。
[0042]以上所述實施例是本發(fā)明的較佳實施例。本發(fā)明的保護范圍不限于實施例列舉的 范圍，凡依本發(fā)明專利申請范圍所述的特征及原理所做的等效變化，均包括在本發(fā)明專利 申請范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種制備競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)預(yù)包被固相抗體的方法，其特征在于:包括以下 步驟：以碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液為包被緩沖液，將第二抗體用包被緩沖液稀釋至濃 度為1.0~10μg/ml，加入96孔不透明微孔板中，孵育后棄去孔中液體，再用含牛血清白蛋白 的磷酸鹽緩沖液作為封閉緩沖液，將抗體用封閉緩沖液稀釋至合適的濃度，加入微孔板中， 孵育后棄去孔中液體。最后干燥密封后進行保存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的競爭法化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)，指以96孔不透明微孔板為分離介 質(zhì)，辣根過氧化物酶標記抗原為示蹤方法，酶催化魯米諾產(chǎn)生發(fā)光，標記抗原與待測抗原競 爭結(jié)合抗體的免疫反應(yīng)，一般用于小分子抗原濃度的測定。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的第二抗體，其特征在于：當抗體為羊抗體、兔抗體或鼠抗體時， 相應(yīng)的第二抗體分別為抗羊IgG、抗兔IgG或抗鼠 IgG。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的孵育，其特征在于:加入液體體積為100ul~200ul，在溫度為2 ~37 °C條件下，靜置時間為2~72小時。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的96孔不透明微孔板，其材質(zhì)為聚苯乙烯，可以為白色或黑色不 透明，每板有96個微孔，可以分拆。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液，PH為7.0~9.6， 濃度為〇. 〇 1~〇. 05M，封閉緩沖液為磷酸鹽緩沖液，PH為7.0~7.5，濃度為0.01~0.05M，含 牛血清白蛋白0~2%，新生牛血清0~10%，蔗糖0~20%，海藻糖0~5%。
【文檔編號】G01N33/531GK106053785SQ201610325806
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】鄭嘉庚, 秦偉濤, 潘國華, 谷澤亮
【申請人】北京北方生物技術(shù)研究所有限公司