高靈敏度電噴射接口的制作方法
【專利說明】高靈敏度電噴射接口
[0001 ] 相關(guān)申請
[0002]本申請根據(jù)U.S.C.§119(e)的規(guī)定要求下述在先申請的優(yōu)先權(quán):2013年8月29日提交的美國臨時專利申請61/871，562，其在此通過引用納入本文。
[0003]政府資助
[0004]本發(fā)明獲得了由Nat1nal Institutes of Health提供的項目編號為R01GM096767的政府資助。美國政府對于本發(fā)明擁有一定的權(quán)益。
【背景技術(shù)】
[0005]自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)(Bottom-upProteomics)是鑒定蛋白質(zhì)以及在質(zhì)譜分析之前通過蛋白水解消化描述其氨基酸序列和轉(zhuǎn)譯后修飾的實用方法。自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛用于定性和定量分析復(fù)雜的生物樣品。由微克的物料，有可能從哺乳動物細(xì)胞溶解產(chǎn)物鑒定超過10，000種蛋白質(zhì)以及從原核生物溶解產(chǎn)物鑒定超過2，500種蛋白質(zhì)。自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對于質(zhì)量有限的樣品，例如激光捕獲微小切割組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、單胚和單體細(xì)胞，操作性能會迅速降低。
[0006]有少量的報道涉及采用毛細(xì)管液相色譜(LC)-電噴射離子化(ESI)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)方法納克樣品的自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)。Mann團(tuán)隊從具有幾百ng蛋白質(zhì)含量的單一胰島細(xì)胞鑒定出2，000種蛋白質(zhì)(ffaanders et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009，106，18902) aKarger團(tuán)隊從50ng的醋酸甲燒八疊球菌(Methanosarcinaacetivorans)消化物鑒定出566種蛋白質(zhì)(Yue et al.，Anal.Chem.2007，79，938)，并且從?2.5ng的宮頸癌細(xì)胞株的胰蛋白酶消化物鑒定出163種蛋白質(zhì)(Luo et al.，Anal.Chem.2007，79，6174)。Smith小組利用精確質(zhì)量和時間標(biāo)簽(AMT s ) [ 8 ]的方法從低微克量的耐輻射球菌(Deinococcusrad1durans)消化物中檢測出870種蛋白質(zhì)(Smith et al.，Proteomics2002，2，513)。31^訪團(tuán)隊還報告了采用411'方法在0.5?8的樣品中檢測到三種最大豐度的蛋白質(zhì)，并且報告在牛血清蛋白(bovine serum albumin)消化產(chǎn)物中對一種蛋白質(zhì)的?1zmoIe檢測極限(Shen et al.,Anal.Chem.2004,76,144) C3Dovichi及其同事利用具有高能碰撞離解的Q-Exactive質(zhì)譜儀(Olsen et al.，Nat.Methods2007，4，709)從Ing的RAW264.7巨■細(xì)胞株消化物中鑒定出?100種蛋白組(Sun et al.,Rapid Commun.MassSpectrom.2013，27，157)。所有這些分析都需要至少一個小時的儀器時間。因此，對飛克(femtogram)量的蛋白質(zhì)消化物的更為快捷的自下而上分析方法對于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域是非常有價值的。
[0007]毛細(xì)管區(qū)帶電泳-電噴射離子化-串聯(lián)質(zhì)譜(CZE-ES1-MS/MS)對于自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)受到關(guān)注，并且，對于低納克樣品來說，這種方法一致地優(yōu)于LC-MS/MS方法。對于微小樣品量而言CZE的改良性能大概是由于其非常簡單的設(shè)計以及在噴射器和配件中消除了樣品損耗。從Smith團(tuán)隊的開創(chuàng)性工作入手(Smith et al.,Anal.Chem.1988，60，1948)，為了毛細(xì)管電泳已經(jīng)開發(fā)電噴射接口(Maxwell et al.，Anal.Chim.Acta2008，627，25)。然而，有必要開發(fā)出新的接口以降低因低鞘流率引起的樣品稀釋，免除機械栗，允許較寬范圍的分離緩沖，以及在納噴射狀態(tài)的穩(wěn)定操作。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明提供了一種基于改進(jìn)的動電栗鞘流接口的超靈敏和快速的毛細(xì)管區(qū)帶電泳-電噴射離子化-串聯(lián)質(zhì)譜(CZE-ES1-MS/MS)系統(tǒng)。所述接口有多方面的優(yōu)點，包括由于很低的鞘流率減少樣品稀釋，免除機械栗，允許較寬范圍的分離緩沖，與商業(yè)毛細(xì)管電泳設(shè)備的相容性，以及在納噴射狀態(tài)的穩(wěn)定操作。所述系統(tǒng)對于飛克(femtogram，毫微微克)量蛋白質(zhì)消化物的快速自下而上分析是非常有用的并且能夠提供極高的靈敏度。
[00?0] 于是，本發(fā)明提供了一種鞘流接口(sheath-flow interface)，用來從毛細(xì)管中形成電噴射，其中，所述接口包括:
[0011](a)毛細(xì)管，設(shè)置為含有被測物液體，所述毛細(xì)管具有用來接收被測物液體的注射端以及用來排放被測物流出物的末端，其中所述末端的部分的外徑逐漸縮減到大約20μπι到大約200μηι范圍的較小外徑；
[0012](b)電噴發(fā)射體發(fā)射體，同軸地設(shè)置于至少在所述毛細(xì)管的末端周圍，所述電噴發(fā)射體發(fā)射體具有末端，其逐漸變小終止于開口，所述開口被相對于所述毛細(xì)管的末端同軸設(shè)置；以及
[0013](c)鞘液儲存器，流體地連通到所述電噴發(fā)射體發(fā)射體的內(nèi)部，使得導(dǎo)電的鞘液能夠流出所述鞘液儲存器，經(jīng)過所述毛細(xì)管和所述電噴發(fā)射體發(fā)射體的中間連接器件，穿過所述毛細(xì)管的末端，并且通過所述電噴發(fā)射體發(fā)射體的末端的所述開口。
[0014]所述鞘流接口可以設(shè)置為使得所述毛細(xì)管的末端和所述電噴發(fā)射體發(fā)射體的孔口在所述電噴發(fā)射體發(fā)射體內(nèi)以約750μηι到約I OOnm的距離分開。在一些實施方式中，其中所述毛細(xì)管的外徑小于所述發(fā)射體發(fā)射體孔口的直徑，所述毛細(xì)管的末端可被設(shè)置為處于所述發(fā)射體發(fā)射體孔口的開口之內(nèi)。另外，所述毛細(xì)管的末端可以從所述發(fā)射體發(fā)射體孔口的開口伸出達(dá)大約ΙΟΟμπι。
[0015]所述鞘液能夠提供所述毛細(xì)管和所述電噴發(fā)射體發(fā)射體之間的電接觸。所述鞘流接口可以設(shè)置用來由鞘流和所述被測物流出物混合的動電流形成納噴射。此外，所述動電流可以通過所述電噴發(fā)射體發(fā)射體和與所述發(fā)射體發(fā)射體的所述開口接近但無物理接觸的目標(biāo)面之間的電勢產(chǎn)生。
[0016]在各種實施方式中，所述毛細(xì)管的末端的外徑可以是約20μπι到約75μπι，或者約45μm至約65μηι。所述末端的逐漸縮減到較小外徑的部分可以是長度為大約0.1mm到大約10mm，尤其是大約5mm的部分。
[0017]所述鞘流接口，當(dāng)與毛細(xì)管區(qū)帶電泳裝置和串聯(lián)質(zhì)譜儀配置時，可以在不到12分鐘或不到10分鐘的質(zhì)譜儀器時間內(nèi)從400飛克(f emtograms)的肽類樣品中檢測出多個肽類。所述肽類包括肽消化物，例如E.col i胰蛋白酶消化物。
[0018]所述鞘流接口可以配置毛細(xì)管區(qū)帶電泳裝置和質(zhì)譜儀，其中多于150種肽類能夠通過精確質(zhì)量和時間標(biāo)記從亞皮克(sub-p i cogram)量的復(fù)合蛋白質(zhì)消化物中在不到12分鐘、通常不到20分鐘的質(zhì)譜儀時間內(nèi)被鑒別出來。
[0019]所述質(zhì)譜檢測極限能夠是大約1-1OiX摩爾(zeptomoles)，例如可以低到大約IiX摩爾(zeptomole)。
[0020]本發(fā)明還提供了一種方法，用于分析蛋白質(zhì)消化物，包括將權(quán)利要求1所述的鞘流接口配置毛細(xì)管區(qū)帶電泳裝置，其中所述分析物通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳在分離毛細(xì)管中被分離，并且施加約1kV的電勢提供大約300V/cm的電場，以形成寬的分析物分離窗區(qū)，在此期間，分析物從所述毛細(xì)管在大約60分鐘內(nèi)迀移至所述接口。對于肽類分離，可獲得平均的250，000理論板到大約350，000理論板。
[0021]在一些實施方式中，所述鞘流接口的分離毛細(xì)管的內(nèi)徑為約5μπι到約75μπι。在不同的實施方式中，噴射的總流率為約15到約200nL/minute，約20到約200nL/minute，約15到約25nL/minute，或者約20nL/minute。所述方法可包括將本文所述的鞘流接口配置串聯(lián)質(zhì)譜儀，其中所述鞘流接口被配置向質(zhì)譜儀提供納噴射進(jìn)行分析，其中所述目標(biāo)表面是質(zhì)譜儀的輸入孔口，并且其中所述蛋白質(zhì)樣品的檢測下限為大約3飛克(femtograms)至大約5飛克。所述被分析肽類的檢測極限可以為大約I仄摩爾(zeptomole)，尤其是對于較小內(nèi)經(jīng)的分離毛細(xì)管(例如，直徑小于大約15微米，特別是大約10微米)。為了實現(xiàn)很低的質(zhì)量檢測極限，需要使用高靈敏度的質(zhì)譜儀。高靈敏度質(zhì)譜儀的一個實例是Q-Exactive Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific Inc.)。所述被分析肽類的信噪比可以是大約260:1到大約300:1。
[0022]本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種方法，從而利用本文所述的鞘流接口從毛細(xì)管的分析物流出液形成納噴射，包括施加電壓到鞘液儲存器足以驅(qū)動鞘液儲存器中鞘液的電滲流，通過所述毛細(xì)管和所述電噴發(fā)射體發(fā)射體之間的連接構(gòu)件，穿過所述毛細(xì)管的末端，并且通過所述電噴發(fā)射體發(fā)射體的末端的開口，其中所述分析物流出液在毛細(xì)管內(nèi)通過電壓施加到所述毛細(xì)管的注射端并由毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行分離。
[0023]在不同的實施方式中，所述分析物液體可利用動電力或機械栗力經(jīng)由所述毛細(xì)管發(fā)生移動。所述分析物液體可在毛細(xì)管內(nèi)被分離，其中采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束動電色譜、毛細(xì)管電色譜、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管液相色譜法，或其組合。所述納噴射可以通過例如電滲流而形成。所述分析物液體可在毛細(xì)管內(nèi)通過電泳分離，其中所述納噴射通過電滲流產(chǎn)生，并且其中的電泳和電滲流都是通過在所述毛細(xì)管的注射端、所述鞘液儲存器和所述目標(biāo)表面之間施加電勢而被驅(qū)動。所述分析物液體可以通過色譜法分離，其中物流被通過常規(guī)液相色譜中的機械栗或通過電色譜中動電流驅(qū)動;這些情況下，電噴射可在發(fā)射體發(fā)射體內(nèi)通過電滲流驅(qū)動。
[0024]所述鞘流接口可設(shè)置為向質(zhì)譜儀作為分析提供納噴射，并且其中所述目標(biāo)表面是質(zhì)譜儀的輸入孔口。所述目標(biāo)表面可以保持接地或者所述目標(biāo)表面可以持有電位。所述鞘液可配置以提高分析物流出液與質(zhì)譜儀的相容性能。電噴發(fā)射體發(fā)射體末端的開口的直徑可以是約0.5μπ?到約50μ??，或者約0.5μπ?到約30μ??。
[0025]本發(fā)明還提供了一種方法，用于分析諸如蛋白質(zhì)消化物的生物分子。所述方法可以包括從蛋白質(zhì)消化物形成分析物流出液，并且，利用前述實施方式的流鞘接口，形成從毛細(xì)管的分析物流出液的納噴射。所述形成分析物流出液納噴射的方法可以包括施加電壓到鞘液儲存器足以驅(qū)動所述鞘液儲存器的鞘流的電滲流，通過毛細(xì)管和電噴發(fā)射體發(fā)射體之間的連接構(gòu)件，穿過毛細(xì)管的末端，并且經(jīng)過位于所述電噴發(fā)射體發(fā)射體末端的開口。所述分析物流出液在毛細(xì)管內(nèi)通過施加電壓到毛細(xì)管注射端的毛細(xì)電泳進(jìn)行分離。
[0026]附圖簡要說明
[0027]下述附圖屬于說明書的一部分并且是用來對本發(fā)明的一些實施方式或不同方面作進(jìn)一步的描述。在一些實例中，本發(fā)明的實施方式可以通過參照附圖并結(jié)合本文提供的詳細(xì)描述得到更好地理解。這些描述和附圖可以突出某些具體的實施例或者本發(fā)明的某些方面。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這些部分的實施例或方面也可用于結(jié)合本發(fā)明的其他實施例或方面。
[0028]圖1.(A)根據(jù)所公開實施方式的典型的接口的示意圖。(B)帶有質(zhì)譜儀的典型的接口的示意圖。所述鞘液可以被HV2和質(zhì)譜儀入口之間電勢差驅(qū)動的動電流栗送。所述分離作用可通過所述毛細(xì)管的入口(HVl)和出口(HV2)之間的電勢差來驅(qū)動。
[0029]圖2.根據(jù)一種實施方式的接口的組成。
[0030]圖3.CZE-ES1-MS/MS系統(tǒng)。所述系統(tǒng)的略圖(A)，電噴射發(fā)射體發(fā)射體中的蝕刻毛細(xì)管的略圖(B)，以及所述發(fā)射體發(fā)射體中蝕刻毛細(xì)管的顯微圖(C)。
[0031]圖4.利用CZE-ES1-MS/MS基于串聯(lián)光譜鑒別從16pg量E.coli分析三重的50種高強度肽類的提取離子電泳圖。提取的質(zhì)量公差為2ppm。
[0032]圖5.針對16量E.coli消化物每組三重的肽迀移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分布。所選擇的電泳圖是從154種高強度肽生成的。肽峰值提取的質(zhì)量公差為3ppm。對電泳圖進(jìn)行高斯函數(shù)擬合，采用無監(jiān)督非線性最小二乘擬合:Intensity(t) = a X exp-0.5*(t-to)2/width2+off set;其中t為時間，to為峰值迀移時間，a為峰值幅度，width為根據(jù)高斯標(biāo)準(zhǔn)偏差的峰值寬度，而offset是指dc偏移。采用MATLAB的擬合程序進(jìn)行計算。各個電泳圖中最高值的振幅和迀移時間被用作初始推測值a和to。對于width的初始推測值為3秒。對off set的初始估計值為所述電泳圖的中值。對于三重的每樣的電泳圖迀移時間的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏差計算為std(to)/mean(t0) X 100%。
[0033]圖6.針對16pg量E.co I i消化物三重樣品通過CZE-ES1-MS/MS鑒別的肽類的峰值寬度分布。峰值寬度是采用圖5所述的非線性回歸分析確定。高斯函數(shù)半高處的總寬度=2.35X width，而在基線處的總寬度是4 X width。
[0034]圖7.針對16pg量E.co I i消化物三重樣品通過CZE-ES1-MS/MS鑒別的肽類的理論板數(shù)(N)分布。理論板數(shù)的計算為N= (to/width)2，其中to和width是采用圖5所述的非線性回歸分析確定。
[0035]圖8.從16pg量E.coli消化物的不同測試分析獲得的肽強度的相關(guān)性(A:對比16pg量E.co I iji試I的肽強度和16pg量E.co I iji試2的肽強度;B:對比16pg量E.co I iji試I的肽強度和16pg量E.coliJi試3的肽強度；C:對比16pg量E.coliJi試2的肽強度和16pg量E.col i_測試3的肽強度)。肽強度是利用數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果而獲得，采用了 MaxQuantsoftware(v.1.3.0.5)軟件，是總括的與被鑒別肽序列相關(guān)的全部同位素族的extracted1n Current(XIC)0
[0036]圖9.加載量的E.coli消化物和基于串聯(lián)光譜(點由線連接)及精確數(shù)量和時間標(biāo)記(Star = AMTS)的鑒定之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)鑒別(A);肽鑒別(B)。每個樣品均進(jìn)行二重或三重的分析。所述基于AMTs從400fg量E.coli消化物的鑒別用星來標(biāo)示。誤差條為平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0037]圖10.由400fg量被鑒別肽獲得的提取離子電泳圖(上部)，以及由16pg量E.coli消化物相應(yīng)的電泳圖(下部)，其基于精確質(zhì)量和時間標(biāo)記(AMTs)方法(其它153對電泳圖未示出)。用于峰值提取的質(zhì)量公差為3ppm。
[0038]圖11.被鑒別的三種熱不穩(wěn)定延伸因子(elongat1nfactor Tu)肽提取電泳圖(A，B和C)，其為通過MS/MS從400fg量的E.coli消化物進(jìn)行肽的檢測極限計算。
[0039]圖12.血管緊張素II的加載量和碎片離子(y2+和b6+)強度在CZE-PRM分析之后的寬動態(tài)范圍校正曲線。所述曲線為針對對數(shù)數(shù)據(jù)未加權(quán)線性擬合的結(jié)果。
[0040]圖13.來自三重的CZE-PRM分析的迀移時間和血管緊張素II碎片離子(y2+)對于不同加載量(2amo I e-150f mo I e)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)。
[0041 ]圖14.在CZE-ES1-MS分析之后MCF7消