磁性分離的制作方法
【專利說明】磁性分離
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2013年11月25日提交的美國臨時申請序列號61/908,473的權益，該申請通過引用以其全部內容結合在此。
[0003]背景
[0004]生物分子的分離是任何樣品加工系統(tǒng)的關鍵部分。對于所有生物化學過程來說，靶樣品的分離和純化是其成功的關鍵。生物化學分析過程中的限制-焦磷酸測序、核酸連接、聚合酶鏈式反應、數字PCR、qPCR、核酸測序、蛋白檢測/蛋白強化、遺傳珠涂覆、稀少細胞檢測以及細胞富集-并且不限于這些，歸因于靶標的起始濃度以及分析中使用的反應樣品內存在的生物化學抑制劑的水平。
[0005]對于大多數生物化學分析，要對樣品進行一系列預分析步驟以從最初樣品中分離靶標并且去除生物化學抑制劑。典型地，這些步驟是費時和費力的并且最終降低靶標的起始濃度。
[0006]—種樣品純化方法利用旋轉離心柱。然而，旋轉離心柱需要多個離心步驟，并且因此不可與自動化DNA文庫制備平臺整合。類似地，用于從瓊脂糖凝膠中純化核酸片段的純化技術也需要多個離心步驟以實現核酸分離。
[0007]用于樣品純化的一項技術是基于順磁性珠粒的純化。該方法提供了一種可提供改進的DNA恢復率和可調緩沖條件的途徑，這些條件可以用于選擇性地結合特定的DNA片段大小。
[0008]該基于順磁性珠粒的純化是一種靜態(tài)孔分批法。當前的方法涉及將珠?；旌衔?順磁性珠粒和一種緩沖液-連同最初樣品移液至微量滴定板的孔中。將該溶液移液、混合、并在室溫下孵育以使DNA結合至這些珠粒。然后將該微量滴定板置于磁性板上。具有該結合的DNA的這些珠粒移動到該板的邊緣并且被磁體保持。接下來，使用移液管將上清液(包含廢物)去除并且丟棄。然后進行多個洗滌步驟以去除存在于珠狀小球上/處的殘余廢物。將乙醇移液至含有該珠狀小球的板，孵育并且然后使用移液管去除。重復該洗滌步驟兩次。然后添加洗脫緩沖液。將該板從該磁性板中移除，并且通過移液管混合將該洗脫緩沖液混合。將該微量滴定板放回到該磁性板上。然后，使用移液管將含有經純化的DNA的洗脫液取出。
[0009]該基于順磁性珠粒的方案是一項勞動密集型過程，并且其自動化是復雜的。移液步驟數量多還導致最初和最終樣品體積大，從而導致每數據點的高試劑成本。
[0010]—種應用并且不限于該應用是為了用于下一代測序平臺的改進的樣品純化。很多下一代測序平臺需要多個由特定范圍內的堿基對長度的DNA片段組成的DNA文庫。此外，這些DNA片段需要用特定核苷酸序列(接頭)進行標記以使得使用PCR對這些序列進行擴增并且使得這些文庫片段退火至測序儀流動池。當在單一流動池內復用樣品時，還可以向這些DNA片段中添加序列特異性指標以識別單獨樣品。DNA的標記片段化(tagmentat1n) (DNA被片斷化并用接頭進行標記)以及常用接頭和指標的添加在兩個單獨的生物反應中實現。在這些反應后，清潔該DNA文庫以移除過量的核苷酸、酶、引物、鹽及其他污染物。因此，標記片段化DNA、純化經標記片段化的DNA、添加常用接頭和指標以及純化最終文庫產物所需要的工作流程是復雜且勞動密集型的。
[0011]本文概述的系統(tǒng)和方法可有助于實現樣品處理，該樣品處理可減少(在某些實施例中可去除)污染并且可實現低體積、高通量、低成本和/或高樣品濃度。
[0012]概述
[0013]復合液體池處理系統(tǒng)用于進行樣品處理，并且因此通常包括從周圍樣品中磁力分離目標分子的能力。高效磁性分離在樣品和試劑體積較小、單個細胞中的靶分子數目也相應較小的復合液體池中特別重要。雖然針對復合液體池處理的應用而對在此處描述的某些具體實施例進行了優(yōu)化，所述的裝置和方法也廣泛適用于具有和不具有復合液體池的系統(tǒng)。
[0014]披露了用于對順磁性珠粒進行磁性分離而用于生物分子的分離和處理的裝置、系統(tǒng)和方法。
[0015]附圖簡述
[0016]圖1是一種液體處理系統(tǒng)的不意圖。
[0017]圖2A-C展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的歧管層。
[0018]圖3A-E展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的磁體層。
[0019]圖4展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的管導層。
[0020]詳細描述
[0021]如在先前的申請(如美國專利公開號US 20120045765、美國專利公開號US20130280726、PCT公開號WO 2012011091、PCT公開號WO 2013111016和PCT公開號WO2014083435，所有這些專利特此通過引用以其全文結合在此)中所解釋的，可使用流體處理系統(tǒng)生成復合液體池。這種流體處理系統(tǒng)可具有用于吸取和分配液體的液體導管。這些液體導管可以移動并對準用于從現有的復合液體池中或從其他位置或結構中吸取和分配流體的特定位置。
[0022]在一些實施例中，有利的是具有共同作用的多個液體導管。這些液體導管可以布置成任何形式，例如布置成一條線、矩形或笛卡爾網格或六邊結構。每個液體導管通常具有工作端，可從該工作端分配液體，并且可將液體吸入工作端。這些液體導管可以是毛細管，即具有親水性的內表面以及必要的幾何形狀而通過毛細作用吸入水溶液或純水?？商娲?，在工作端的對側，這些液體導管可以附接到能夠產生足以吸入液體或空氣的負壓的栗上。這種栗還可以被構造成產生正壓以將液體從所述導管的工作端分配出去。不管液體導管是否能夠產生毛細作用，都可以包括栗。
[0023]在許多生化實驗方案中，從較大的生物樣品中分離目標生物分子(例如DNA)是有用的或必需的。用于這種分離的一種方便的方法是通過使目標分子與磁性珠粒在溶液中結合，施加磁場而使珠粒與其結合的目標分子固定，并且使洗滌溶液流經固定化的珠粒以除去除了固定結合的目標分子以外的其他原始樣品材料。一旦目標分子已被如此分離，可以去除磁場，并且釋放目標分子用于進一步的處理。
[0024]這種磁性分離可在如上所述的流體處理系統(tǒng)中來完成。一個或多個磁體可與各液體導管相關聯。磁體可以連接到致動器或能夠在至少兩個位置之間移動各磁體的致動器，在第一個位置處，磁體與液體導管間隔開，在第二位置處，磁體與液體導管并置。在一些實施例中，兩個磁體可與各液體導管相關聯。磁體可以沿著導管的流動軸線的方向而間隔開。將磁體沿著導管的流動軸線的方向而間隔開可以提高分離效率。流過第一個磁體時未被固定的任何珠粒隨后會流過第二個磁體。鑒于給定的珠粒在經過單個磁體時無法被固定的可能性較小，珠粒在經過兩個磁體時無法被固定的可能性會更小，是較小可能性的平方。這種效率的提高在處理復合液體池時是有利的，因為所涉及的體積如此之小。當用較大量液體進行處理時，不能使一小部分磁性珠粒固定化不用太多關注。自然地，如果需要更高效的固化化，可以使用串聯的三個、四個或更多的磁體。
[0025]在圖1中展示了這種流體處理系統(tǒng)的一個實施例。系統(tǒng)I具有三層:歧管層2、磁體層3和管導層4。為了清楚起見，示出了沒有液體導管的系統(tǒng)。
[0026]圖2A單獨地展示了歧管層2。歧管層2包括四個通常是線性的模塊201、202、203、204，各模塊具有六個輸入口 205。圖2B示出了單獨的一個單線性模塊204，可從模塊204的頂部看到其輸入口 205。圖2C示出了同一個線性模塊204，其近壁面被去除以展現模塊的內部。各輸入口 205連接到將流體路徑分成四個輸出口的支管206。輸出口位于歧管層2面向磁體層3的一側。因此，歧管層2將總共二十四條輸入管線分成九十六條輸出管線。而在一些實施例中，歧管可構成所展示的單獨的線性模塊，在另一些實施例中，歧管可以是一個單一元件，在某些情況下是整體件或整合件。在一些實施例中，歧管可由如圖2A-C所示可以是線性的或可以不是線性的較小的模塊的組合組成。在任何給定的實施例中，歧管中的端口數目不必是如圖所示的96個，可以為特定的應用而進行調整，如可以是輸入和/或輸出口的幾何布局。
[0027]圖3A單獨地展示了磁體層3。磁體層3包括四個二十四線磁體模塊301、302、303、304 ο圖3B單獨地展示了單磁體模塊304。磁體模塊包括插口 305、以及可在插口 305內可滑動地移位的磁體螺栓306。圖3C示出了同一個磁體模塊304，將其插口 305的一側移除以便看到磁體螺栓306的整個長度。槽縫307會保持磁體，為了清楚起見將其省略。圖3D以橫截面示出了磁體層3。該橫截面穿過液體導管308，并且示出了與液體導管308對齊的磁體槽縫307。圖3E以水平截面示出了磁體層3，以便可以看到所有的九十六個磁體槽縫307。
[0028]磁體螺栓306可被致動器擊發(fā)到插口305中的完全插入的位置。如圖3A_E所示，在這個完全插入的位置，兩個磁體與各液體導管是并置的。可替代地，致動器可將螺栓306移動到撤回位置，未示出。磁體螺栓306位于兩行(各十二個液體導管)之間。在所示的實施例中，磁體螺栓306可包含四十八個磁體，每個液體導管308有兩個，在每個槽縫307中有兩個分立的磁體?？商娲?，每個螺栓可只包括十二個磁體槽縫，每個槽縫中有兩個單獨的磁體，這些磁體水平穿過螺栓，以便每個磁體可在螺栓306的對側與兩個液體導管并置。磁體螺栓306可包含二十四個磁體，設置這些磁體按大小并安排在螺栓中，以便當螺栓被擊發(fā)時，每個磁體與兩個液體導管并置，螺栓的每側各有一個。在其他實施例中，可能有磁體的不同安排。
[0029]圖4展示了管導層4。管導層的功能是保持液體導管筆直。盡管為了清楚起見已經省略了，管導層4通常會通