基于金納米粒構(gòu)建的比色生物傳感器用于乳腺癌細(xì)胞中三磷酸腺苷的含量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于AuNPs構(gòu)建的比色傳感器用于簡便、迅速、靈敏性檢測乳腺癌細(xì)胞中腫瘤標(biāo)志物三磷酸腺苷的含量檢測新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一種核苷酸[1]，又稱腺嘌呤核苷三磷酸。ATP是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動所需能量的直接來源，儲存和傳遞化學(xué)能，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成代謝，可促使機(jī)體各種細(xì)胞的修復(fù)和再生，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性，對治療各種疾病均有較強(qiáng)的針對性。并且細(xì)胞中ATP的含量還和許多疾病如貧血、低血糖、心血管疾病以及癌癥等有著密切的關(guān)系，因此發(fā)展一種高效靈敏的方法去檢測ATP分子有著非常重要的意義。
[0003]傳統(tǒng)的ATP檢測方法有電泳法[2]、高效液相色譜法[3]和同位素示蹤法[4]等。這些方法存在著操作過程復(fù)雜、試劑費(fèi)用昂貴、不能定點(diǎn)實(shí)時迅速檢測的問題，因此，構(gòu)建一種準(zhǔn)確、靈敏、簡便價廉的ATP檢測方法尤為必要。
[0004]比色法操作非常簡單，而且結(jié)果可以用肉眼很容易觀察到，大多數(shù)情況也不需要用到精密的儀器。AuNPs由于具有較高的吸光系數(shù)、小尺寸效應(yīng)[5]等光性質(zhì)可作為比色傳感器的傳感元件，表現(xiàn)為分散良好的AuNPs水溶液呈現(xiàn)酒紅色，由于表面等離子體吸收波長變長，聚集的AuNPs呈現(xiàn)藍(lán)色或紫色。
[0005]4_疏基苯硼酸(4-Mercaptophenylboronic acid，MPBA)含有一個疏基和一個連在對位的硼酸基團(tuán)JPBA與雙醇基特征反應(yīng)表現(xiàn)為硼酸基團(tuán)及其衍生物在pH值為6-10范圍內(nèi)可以與I，2_或I，3_戊二醇進(jìn)行可逆的反應(yīng)形成穩(wěn)定的5元或6元環(huán)硼酸酯[6—7^ATP結(jié)構(gòu)中具有I，2-雙醇基，因此，硼酸與雙醇的特征反應(yīng)是一個可供選擇的檢測ATP的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種基于金納米粒構(gòu)建的比色生物傳感器用于乳腺癌細(xì)胞中三磷酸腺苷的靈敏檢測的方法，該方法簡便、迅速、靈敏性高。
[0007]該方法利用4-巰基苯硼酸(MPBA)的巰基與AuNPs通過Au-S鍵共價結(jié)合，在未加ATP時，硼酸基團(tuán)作為交聯(lián)劑發(fā)生自身三分子脫水縮合引起AuNPs團(tuán)聚顯藍(lán)色;加入ATP，時，ATP分子中順式鄰二醇結(jié)構(gòu)與硼酸基團(tuán)發(fā)生特異酯化反應(yīng)使AuNPs分散而顯紅色。
[0008]AuNPs的吸收峰在520nm，聚合物吸收峰在波長為683nm，以A52o/A683吸收比值與ATP濃度進(jìn)行線性擬合，其線性范圍為8.0-100μΜ，檢測限為0.12μΜ。
[0009]我們基于AuNPs抗聚集特性首次建立了一種簡便、快速、高選擇性的ATP的比色傳感新方法，并實(shí)現(xiàn)了 T47D乳腺癌細(xì)胞中ATP靈敏快速含量檢測，在臨床腫瘤診療方面有著潛在的應(yīng)用價值。
[0010]本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0011]—種基于金納米粒(AuNPs)構(gòu)建的比色傳感器用于簡便、迅速、靈敏性檢測乳腺癌細(xì)胞中腫瘤標(biāo)志物三磷酸腺苷的含量檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0012]吸取AuNPs至離心管中，加入用PKS緩沖液稀釋40-60倍ATP乳腺癌細(xì)胞提取液，孵化3-7min得到混合物，加入4-巰基苯硼酸至混合物中，再加入PKS緩沖液反應(yīng)10-15min，觀察顏色變化，采用紫外分光光度計，以A52Q/A683吸收比值與ATP濃度進(jìn)行線性擬合，外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再進(jìn)行樣品濃度的測定。
[00?3 ] AuNPs由梓檬酸還原法制備得到。AuNPs的具體制備步驟如下:取25mM氯金酸5mL，加入120mL雙蒸水，120°C攪拌加熱至沸騰，然后快速傾入12.5mL檸檬酸鈉(38.8mM，I % )，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3Omi η，得到的酒紅色AuNP s，冷卻至室溫。AuNP s濃度可以為2.7nM，即吸取1.35mL 3nM AuNPs溶液，反應(yīng)總體積為1.SmLJnM為AuNPs母液稀釋4倍。
[0014]MPBA作為AuNPs交聯(lián)劑，MPBA的濃度為3-7μΜ，即吸取6yL ImM MPBA溶液，反應(yīng)總體積為1.5mL。
[0015]本發(fā)明中，MPBA硼酸基團(tuán)識別ATP順式雙醇，反應(yīng)生成硼酸酯結(jié)構(gòu)，ATP發(fā)揮AuNPs抗聚集特性。加入MPBA之后，反應(yīng)10分鐘觀察顏色變化并進(jìn)行紫外檢測。MPBA的作用為ATP識別分子
[0016]比色反應(yīng)體系為KH2PO4-NaOH(PKS)緩沖鹽;PKS緩沖液離子強(qiáng)度范圍為75-125mM，PKS緩沖體系pH范圍為6.5-7.5;反應(yīng)溫度范圍為0_25°C。
[0017]ATP濃度可以為ΙΟΟμΜ，即吸取10yL 1.5mM ATP溶液，反應(yīng)總體積為1.5mL。未加入MPBA之前，ATP孵化時間為5分鐘。
[0018]ATP乳腺癌細(xì)胞提取液的制備步驟如下:T47D細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，每3mL的T47D細(xì)胞樣品中含細(xì)胞數(shù)8.3 X 16個，取3mL含細(xì)胞的培養(yǎng)液，在3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心7分鐘，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌離心所得細(xì)胞，并將其重新分散于200yL的PKS緩沖溶液中，然后，將細(xì)胞放在O °C的冰水混合物中超聲2 O m i η，以使細(xì)胞破碎，然后再在4 °C，18000rpm條件下超濾離心20min，移去細(xì)胞碎片勻漿，取清液，并重新懸浮在200yL PKS緩沖液中得到ATP乳腺癌細(xì)胞提取液。
[0019]使用Amicon Ultra-0.5超濾離心管進(jìn)行離心。為了避免細(xì)胞中蛋白質(zhì)的干擾，Amicon Ultra-0.5超濾離心管被用于ATP提取液的離心以去除蛋白質(zhì)。
[0020]T47D乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟如下:T47D乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清(FBS)和100IU/mL的青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，孵化器條件為5%C02，37°C。
[0021]本發(fā)明癌細(xì)胞提取液中ATP濃度檢測步驟可以具體如下:吸取1.35mL稀釋4倍的AuNPs至2mL離心管中，加入稀釋50倍ATP細(xì)胞提取液10yL孵化5min。之后加入6yL MPBA(ImM)至混合物中，再加入44yLPKS緩沖液(10mM，pH 7.5)至1.5mL，反應(yīng)lOmin。
[0022]上述步驟中，在ATP不存在的情況下，MPBA的巰基與AuNPs通過Au-S鍵共價結(jié)合，并且三分子的硼酸基團(tuán)自身縮合脫去三分子水形成硼氧六圓環(huán)，PKS緩沖介質(zhì)中AuNPs發(fā)生明顯的聚集而顯藍(lán)色，確定MPBA團(tuán)聚飽和濃度；
[0023]首先加入ATP，ATP結(jié)構(gòu)中的磷酸鹽骨架攜帶負(fù)電荷，增加了AuNPs懸浮液中的靜電斥力，并不使AuNPs發(fā)生聚集;隨后加入已確定濃度的MPBA，通過硼酸基團(tuán)與雙醇的反應(yīng)優(yōu)先與順式-2，3-核糖ATP反應(yīng)生成硼酸酯，保護(hù)AuNPs不通過自身脫水縮合發(fā)生聚集。
[0024]AuNPs比色生物傳感表征中UV-Vis表征利用Shimadzu UV-2450型紫外分光光度計(日本島津公司)測定，光譜掃描范圍400nm-800nm，步長0.Inm; TEM表征將三種樣品分別滴在包覆碳膜的銅網(wǎng)上，在空氣中自然晾干。用FEI透射電鏡(Tecnai G12 Spirit B1 TWIN)測定，加速電壓200V;DLS表征將三種樣品分別用Zetasizer Nano ZS粒度測量儀(英國Malvern公司)測定顆粒水合平均粒徑，設(shè)定溫度為25°C。
[0025]AuNPs抗聚集比色傳感器用于ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限檢測步驟如下:在1.35mL八11肥8中加入10(^1^不同濃度為0.014]\1、0.14]\1、14]\1、1(^]\1、10(^]\1、11111的厶了？溶液孵化 5min，再加入6yL MPBA(ImM)并用PKS緩沖溶液(1001^4!17.5)定容到1.51^，反應(yīng)101^11。肉眼可見隨著ATP濃度的增加體系溶液的顏色從紫色逐漸變成紅色。根據(jù)A520/A683吸收比值與ATP的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為8μΜ-100μΜ，檢測限為0.12μΜ。
[0026]上述方法中ATP的含量為51.30± 1.2μΜ(η = 3)，加樣回收率在99.5%?102.3%之間，RSD小于4.2%。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果:
[0028]I)首次利用ATP雙羥基與MPBA硼酸基成酯的特異反應(yīng)阻礙MPBA自縮合，發(fā)揮ATP的AuNPs抗聚集特性，以AuNPs作為比色探針實(shí)現(xiàn)了 ATP的肉眼可見的快速分析，操作簡單，成本低廉，便于定點(diǎn)實(shí)時檢測。
[0029]2)本方法成功用于乳腺癌T47D細(xì)胞中ATP的靈敏快速檢測，回收率高，實(shí)驗(yàn)誤差小。
[0030]3)基于AuNPs構(gòu)建的比色生物傳感器檢測ATP為生物分子的分析研究提供了新思路，在臨床疾病診療方面有著潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0031]圖1為AuNPs抗聚集檢測ATP原理示意圖
[0032]圖2為實(shí)施例1中比色傳感檢測原理的UV-Vis表征(a.AuNPs b.AuNPs/MPBAc.AuNPs/ATP/MPBA)。溶液中處于良好分散狀態(tài)的AuNPs呈酒紅色，在520nm處有較強(qiáng)的吸收峰(曲線a)。當(dāng)AuNPs中未加入ATP時，溶液的顏色從紅色變成藍(lán)色，可見520nm處的吸收強(qiáng)度降低，在6 8 3nm處出現(xiàn)新的聚合物的吸收峰(曲線b )，表明MPBA使AuNP s發(fā)生了聚集。當(dāng)加入ATP之后，溶液顏色從紅色變?yōu)樽霞t色，可見聚合物的吸收峰消失(曲線c)，證明ATP具有抗聚集作用。
[0033]圖3為實(shí)施例1中比色傳感檢測原理的透射電鏡和動態(tài)光掃描表征(a,d.AuNPsb,e.AuNPs/MPBA c，f.AuNPs/ATP/MPBA)。圖a透射電鏡可見AuNPs粒徑均勻并且處于較好分散狀態(tài)，圖d動態(tài)光散射證明平均粒徑為25nm，證明AuNPs已經(jīng)生成。未加ATP時，圖b可見AuNPs發(fā)生明顯團(tuán)聚成塊，圖e動態(tài)光散射顯示平均粒徑增加到255nm，證明MPBA使AuNPs團(tuán)聚。加入ATP時，圖c可見AuNPs較少聚集，圖f證明平均粒徑減少為40nm。透射電鏡與動態(tài)光掃描結(jié)果一致，結(jié)合紫外圖譜(圖2)證明ATP起到了抗聚集的作用。
[0034]圖4為實(shí)施例1中比色傳感檢測原理的拉曼光譜表征(a.AuNPs b.AuNPs/MPBAc.AuNPs/ATP/MPBA)。分散的AuNPs幾乎無拉曼信號，AuNPs作為襯底對含有巰基的化合物具有很強(qiáng)的表面光增強(qiáng)拉曼效應(yīng)(SERS)，因此結(jié)合了MPBA引起AuNPs團(tuán)聚之后則可以看到很強(qiáng)的拉曼吸收峰，這是由于表面等離子激元耦合形成拉曼熱點(diǎn)，極大的增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度。其中MPBA固體中1335cm—\2555cm—\3045cm—1處的B-O鍵、S-H鍵、-OH的拉曼吸收峰消失(曲線a)，在457cm—1和1473cm—1附近出現(xiàn)氧橋B-O-B的拉曼吸收特征峰(曲線b)，表明MPBA成功組裝到AuNPs表面并發(fā)生了脫水縮合形成B-O-B的六圓環(huán)結(jié)構(gòu)。加入了目標(biāo)物ATP之后(曲線c)，溶液呈分散狀態(tài)，拉曼信號極大減弱，進(jìn)一步說明了ATP的抗聚集作用。
[0035]圖5為實(shí)施例2中構(gòu)建的比色生物傳感器對ATP檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從左到右，ATP濃度分別為8,10,12,20,40,60,80, ΙΟΟμΜ，橫坐標(biāo)為ATP濃度，縱坐標(biāo)為吸光度比值。吸收比(Α683/Α520)隨ATP濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。在8μΜ-100μΜ內(nèi)，AuNPs的吸收比值與ATP的濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為7 = 0.12321+2.9024，1? = 0.9902。用30法可計算出4了？的檢測限為 0.12μΜ。
[0036]圖6為實(shí)施例3中構(gòu)建的比色生物傳感器對T47D乳腺癌細(xì)胞樣品中ATP的檢測與加樣回收率考察。實(shí)際樣品T47D乳腺癌細(xì)胞(?17個，稀釋50