技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于納米材料與生化傳感的交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分的樹枝狀納米復(fù)合物多柔比星電化學(xué)傳感器的制備方法，其制備的傳感器可用于多柔比星的高效檢測(cè)。

背景技術(shù)：
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多柔比星俗稱阿霉素，是一種重要的蒽環(huán)類抗生素，被廣泛應(yīng)用于多種類型腫瘤的治療，如惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、成骨肉瘤等。高劑量的多柔比星對(duì)人體的副作用主要表現(xiàn)為對(duì)骨髓造血功能的損害以及對(duì)心臟的損傷。多柔比星的濃度水平可充當(dāng)一種有效的信號(hào)指示，用于人體健康因子、相關(guān)腫瘤疾病的診斷及治療的監(jiān)控。鑒于多柔比星的以上特征，開發(fā)一種簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)多柔比星的方法對(duì)于腫瘤疾病的診斷和治療具有重要意義。

常規(guī)用于多柔比星定性和定量檢測(cè)的方法包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法、電化學(xué)法等。這些用于多柔比星檢測(cè)的儀器分析方法普遍存在某些缺陷，如復(fù)雜的前處理、耗時(shí)的操作和較低的靈敏性。相比之下，電化學(xué)分析法尤其是電化學(xué)生物傳感器具備顯著的優(yōu)勢(shì)，源于多柔比星分子中苯醌和氫醌結(jié)構(gòu)所引起的優(yōu)異電化學(xué)活性。電化學(xué)生物傳感器的明顯優(yōu)點(diǎn)主要包括操作簡(jiǎn)單、低成本和高靈敏性。在先前的報(bào)道中，不同納米材料改性的電極已被用于電化學(xué)傳感多柔比星，如β-環(huán)糊精-石墨烯雜化物納米片改性玻碳電極(electrochemicalsensorforultrasensitivedeterminationofdoxorubicinandmethotrexatebasedonβ-cyclodextrin-graphenehybridnanosheets,electroanalysis,2011,23,2400)，磁性fe3o4-氧化石墨烯-亞硫酸復(fù)合物膜改性的電極(roomtemperatureinsituchemicalsynthesisoffe3o4/graphene,ceram.int.,2012,38,6411)，石墨烯量子點(diǎn)改性電極(sensingofdoxorubicinhydrochlorideusinggraphenequantumdotmodifiedglassycarbonelectrode,j.mol.liq.,2016,221,354)，氧化型多壁碳納米管改性的電極(electrochemicallyoxidizedmultiwalledcarbonnanotube/glassycarbonelectrodeasaprobeforsimultaneousdeterminationofdopamineanddoxorubicininbiologicalsamples,anal.bioanal.chem.,2016,408,2577)等用于多柔比星電化學(xué)傳感研究。

在這些報(bào)道的多柔比星電化學(xué)傳感研究中，普遍使用了單一的碳納米材料作為底物去修飾電極界面，為進(jìn)一步提高多柔比星電化學(xué)傳感的檢測(cè)效率，有必要引入兩種或多種電活性物質(zhì)作為底物，如貴金屬銀納米顆粒、碳點(diǎn)和還原氧化石墨烯，獲得不同種類電活性物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)，以提高電極界面的電導(dǎo)率，增加表面積和活性位點(diǎn)，加快電子遷移速率，實(shí)現(xiàn)對(duì)多柔比星高靈敏電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)。截至目前，尚未有銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物的制備方法，及其應(yīng)用于多柔比星電化學(xué)高靈敏檢測(cè)相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)和專利等資料報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，設(shè)計(jì)一種方法簡(jiǎn)單、成本低和高靈敏性的基于銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物多柔比星電化學(xué)傳感器的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的基于銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物多柔比星電化學(xué)傳感器的制備工藝包括以下步驟：

(1)采用hummers方法制備氧化石墨烯：將1.0克石墨加入250毫升圓底三口瓶中，滴加25毫升濃硫酸碳化石墨，緩慢攪拌反應(yīng)24小時(shí)，之后加入1.5克高錳酸鉀，將三口瓶轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，然后升溫至60℃，攪拌反應(yīng)45分鐘，其間每間隔15分鐘加入3毫升二次蒸餾水，反應(yīng)完畢后，加入180毫升二次蒸餾水用以終止反應(yīng)，產(chǎn)物冷卻至室溫，將溶液過濾，沉淀物經(jīng)過洗滌干燥，得到氧化石墨烯；

(2)將檸檬酸和碳酸氫銨進(jìn)行溶劑熱碳化制備碳點(diǎn)：將1.0克檸檬酸和2.0克碳酸氫銨溶于10毫升二甲基亞砜中，將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在160℃下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，將反應(yīng)溶液冷卻至室溫后，加入20毫升質(zhì)量濃度為50毫克/毫升的氫氧化鈉水溶液，攪拌反應(yīng)1分鐘，在16000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下用離心機(jī)離心10分鐘，所得沉淀物溶于二次蒸餾水，再次離心分離去除殘留鹽和堿，最后冷凍干燥得到碳點(diǎn)；

(3)將步驟(1)制備的氧化石墨烯與步驟(2)制備的碳點(diǎn)充分混合，配制成質(zhì)量濃度為1.0～2.0毫克/毫升的均質(zhì)碳點(diǎn)/氧化石墨烯水分散液，其中碳點(diǎn)與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1:5～5:1；

(4)在物質(zhì)的量濃度為50毫摩/升的硝酸銀水溶液中加入氨水制備得到40毫摩/升的氫氧化二氨合銀水溶液，將溶液與步驟(3)制備的碳點(diǎn)/氧化石墨烯水分散液混合，制得三者均勻混合的水分散液，碳點(diǎn)/氧化石墨烯與氫氧化二氨合銀質(zhì)量濃度比為1:10～10:1；

(5)將步驟(4)制備的碳點(diǎn)/氧化石墨烯與氫氧化二氨合銀水分散液加入盛有物質(zhì)的量濃度為1毫摩/升的磷酸鹽水緩沖溶液的電解池中，電解池中插入玻碳電極，采用循環(huán)伏安法在玻碳電極界面通過一步電沉積方法將氧化石墨烯和氫氧化二氨合銀共還原成還原氧化石墨烯和銀納米顆粒，循環(huán)伏安法掃描速率為0～50毫伏/秒，掃描電壓0～2.0伏，循環(huán)次數(shù)0～20圈，在玻碳電極界面制備出銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物；

(6)將步驟(5)制得的銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯/玻碳電極電化學(xué)傳感體系作為傳感器，采用差示脈沖伏安法測(cè)定傳感體系的電化學(xué)曲線，擬合氧化電流峰強(qiáng)度ip(微安)與多柔比星濃度([dox],0～250×10^-8摩/升)之間的線性關(guān)系：ip(微安)＝2.197+8.293[dox]，即獲得基于銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物的多柔比星電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用一步電沉積法發(fā)生共還原反應(yīng)在玻碳電極界面制備銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯三組分樹枝狀納米復(fù)合物，基于多柔比星在該復(fù)合物修飾的玻碳電極界面高敏感的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)，可構(gòu)建出高靈敏的多柔比星電化學(xué)傳感器；其制備工藝簡(jiǎn)單，制備成本低，產(chǎn)品靈敏度高，能夠發(fā)展成為一種新穎的電化學(xué)生物傳感器，適用于生物樣品中多柔比星的高效檢測(cè)。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明涉及的納米復(fù)合物電化學(xué)傳感器制備與多柔比星檢測(cè)原理示意圖。

圖2為本發(fā)明涉及的納米復(fù)合物的掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡照片。

圖3為本發(fā)明涉及的銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯-玻碳電極傳感體系對(duì)多柔比星的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)，以及傳感體系氧化電流峰強(qiáng)度與多柔比星濃度之間的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例基于銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯復(fù)合物的電化學(xué)傳感器制備與多柔比星檢測(cè)示意圖參見圖1所示，首先采用hummers方法制備氧化石墨烯：將1.0克石墨加入250毫升三口瓶中，滴加25毫升濃硫酸碳化石墨，緩慢攪拌反應(yīng)24小時(shí)；加入1.5克高錳酸鉀，轉(zhuǎn)移三口瓶至冰浴裝置中冷卻，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘；升溫至60℃，反應(yīng)45分鐘；其間每間隔15分鐘加入3毫升二次蒸餾水，然后加入180毫升二次蒸餾水用以終止反應(yīng)，冷卻產(chǎn)物至室溫，將溶液過濾，沉淀物經(jīng)過洗滌干燥，制得氧化石墨烯。將檸檬酸和碳酸氫銨進(jìn)行溶劑熱碳化制備碳點(diǎn)：將1.0克檸檬酸和2.0克尿素溶于10毫升二甲基亞砜中，將此混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在160℃下反應(yīng)6小時(shí)，冷卻反應(yīng)溶液至室溫，加入20毫升質(zhì)量濃度為50毫克/毫升的氫氧化鈉水溶液，攪拌反應(yīng)1分鐘，在16000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下用離心機(jī)離心10分鐘，所得沉淀物溶于二次蒸餾水，再次離心分離去除殘留鹽和堿，最后冷凍干燥得到碳點(diǎn)。將新制備的氧化石墨烯與碳點(diǎn)充分混合，分別將二者配制成相同質(zhì)量濃度1.0毫克/毫升的水分散液，以體積比3:1充分混合，在室溫下攪拌30分鐘，配制成均質(zhì)混合液；再在50毫摩/升的硝酸銀水溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氨水溶液，充分?jǐn)嚢柚脸吻逋该髦频脷溲趸焙香y水溶液，氫氧化二氨合銀濃度調(diào)節(jié)為40毫摩/升；然后選取一根玻碳電極，將其打磨至鏡面，然后插入1毫摩/升,ph7.0經(jīng)除氧的磷酸鹽緩沖液中，檢測(cè)其電化學(xué)信號(hào)直至達(dá)到穩(wěn)定；將上述的碳點(diǎn)/氧化石墨烯水分散液與氫氧化二氨合銀水溶液以體積比1:1混合作為電解液，再插入打磨后的玻碳電極，采用循環(huán)伏安法對(duì)玻碳電極界面進(jìn)行電沉積處理，其中掃描速率為20毫伏/秒，掃描電壓0～1.0伏，循環(huán)次數(shù)5圈，制得銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯-玻碳電極傳感體系，銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如圖2所示，展現(xiàn)出清晰的三組分樹枝狀納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)；反應(yīng)結(jié)束后，加入10納摩/升～2.5微摩/升多柔比星至電解液中，采用差示脈沖伏安法測(cè)定傳感體系的電化學(xué)曲線，擬合氧化電流峰強(qiáng)度與多柔比星濃度之間的線性關(guān)系，構(gòu)建多柔比星電化學(xué)傳感器(參見圖3)；該傳感器制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，具備高靈敏性和高選擇性，對(duì)多柔比星濃度的檢測(cè)范圍是1納摩/升～5微摩/升，檢測(cè)極限為3納摩/升。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例采用hummers方法制備氧化石墨烯，將檸檬酸和碳酸氫銨進(jìn)行溶劑熱碳化制備碳點(diǎn)(具體方法同實(shí)施例1)，分別將二者配制成相同質(zhì)量濃度2.0毫克/毫升的水分散液，然后以體積比1:1充分混合，在室溫下攪拌30分鐘，配制成均質(zhì)混合液；再在50毫摩/升的硝酸銀水溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氨水溶液，充分?jǐn)嚢柚脸吻逋该髦频脷溲趸焙香y水溶液，氫氧化二氨合銀濃度調(diào)節(jié)為40毫摩/升；選取一根玻碳電極，將其打磨至鏡面，然后插入1毫摩/升,ph7.0經(jīng)除氧的磷酸鹽緩沖液中，檢測(cè)其電化學(xué)信號(hào)直至達(dá)到穩(wěn)定；然后將上述的碳點(diǎn)-氧化石墨烯水分散液與氫氧化二氨合銀水溶液以體積比3:1混合作為電解液，再插入打磨后的玻碳電極，采用循環(huán)伏安法對(duì)玻碳電極界面進(jìn)行電沉積處理，其中掃描速率為30毫伏/秒，掃描電壓0～1.5伏，循環(huán)次數(shù)10圈，制得銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯-玻碳電極傳感體系；反應(yīng)結(jié)束后，加入1納摩/升～5微摩/升多柔比星至電解液中，采用差示脈沖伏安法測(cè)定傳感體系的電化學(xué)曲線，擬合氧化電流峰強(qiáng)度與多柔比星濃度之間的線性關(guān)系，構(gòu)建多柔比星電化學(xué)傳感器；該傳感器制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，具備高靈敏性和高選擇性，對(duì)多柔比星濃度的檢測(cè)范圍是1納摩/升～5微摩/升，檢測(cè)極限為0.3納摩/升。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例采用hummers方法制備氧化石墨烯，將檸檬酸和碳酸氫銨進(jìn)行溶劑熱碳化制備碳點(diǎn)(具體方法同實(shí)施例1)，分別將二者配制成相同質(zhì)量濃度1.5毫克/毫升的水分散液，然后以體積比1:3充分混合，在室溫下攪拌30分鐘，配制成均質(zhì)混合液；再在50毫摩/升的硝酸銀水溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氨水溶液，充分?jǐn)嚢柚脸吻逋该髦频脷溲趸焙香y水溶液，氫氧化二氨合銀濃度調(diào)節(jié)為40毫摩/升；然后選取一根玻碳電極，將其打磨至鏡面，然后插入1毫摩/升,ph7.0經(jīng)除氧的磷酸鹽緩沖液中，檢測(cè)其電化學(xué)信號(hào)直至達(dá)到穩(wěn)定；將上述的碳點(diǎn)-氧化石墨烯水分散液與氫氧化二氨合銀水溶液以體積比1:3混合作為電解液，再插入打磨后的玻碳電極，采用循環(huán)伏安法對(duì)玻碳電極界面進(jìn)行電沉積處理，其中掃描速率為40毫伏/秒，掃描電壓0.5～2.0伏，循環(huán)次數(shù)15圈，制得銀納米顆粒/碳點(diǎn)/還原氧化石墨烯-玻碳電極傳感體系；反應(yīng)結(jié)束后，加入10納摩/升～10微摩/升多柔比星至電解液中，采用差示脈沖伏安法測(cè)定傳感體系的電化學(xué)曲線，擬合氧化電流峰強(qiáng)度與多柔比星濃度之間的線性關(guān)系，構(gòu)建多柔比星電化學(xué)傳感器；該傳感器制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，具備高靈敏性和高選擇性，對(duì)多柔比星濃度的檢測(cè)范圍是10納摩/升～10微摩/升，檢測(cè)極限為4納摩/升。