聚多巴胺納米球生物傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其以直徑為40～400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體，聚多巴胺納米球的表面吸附標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸。本發(fā)明還公開了上述的傳感器在熒光檢測(cè)DNA和凝血酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的聚多巴胺納米球生物傳感器以聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸，利用聚多巴胺納米球優(yōu)異的熒光猝滅特性從而有效的降低背景信號(hào)可提高檢測(cè)的靈敏度，只需通過(guò)普通的熒光分光光度計(jì)就可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的采集，再通過(guò)變化表面吸附的寡核苷酸，從而大大的擴(kuò)寬了其檢測(cè)樣品范圍。
【專利說(shuō)明】聚多巴胺納米球生物傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種聚多巴胺納米球生物傳感器，還涉及該傳感器在檢測(cè)DNA和凝血酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]聚多巴胺是一種在人體中普遍存在的真黑素類高分子物質(zhì)，具有良好的生物相容性和可生物降解的特點(diǎn)。聚多巴胺可以比較容易的通過(guò)堿性條件下多巴胺的自聚合得到。聚多巴胺具有優(yōu)異的熒光猝滅特性，可以有效的猝滅很寬的波譜范圍內(nèi)的熒光分子的熒光。同時(shí)聚多巴胺對(duì)寡核苷酸的不同構(gòu)象具有不同的作用力，能區(qū)分寡核苷酸的不同的構(gòu)象?；诖嗽恚覀儤?gòu)建了吸附寡核苷酸的聚多巴胺納米球生物傳感器，通過(guò)表面吸附的寡核苷酸的對(duì)DNA和凝血酶的特異性識(shí)別作用，引起的寡核苷酸構(gòu)象的變化帶來(lái)的熒光強(qiáng)度的變化，特異性的熒光檢測(cè)DNA和凝血酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供上述生物傳感器在檢測(cè)DNA和凝血酶中的應(yīng)用。
[0004]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其以直徑為40?400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體，聚多巴胺納米球的表面吸附標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸。
[0005]作為優(yōu)選，所述聚多巴胺納米球的直徑為300?400nm。
[0006]作為另一種優(yōu)選，所述熒光分子為羧基熒光素(FAM)。
[0007]作為另一種優(yōu)選，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0008]本發(fā)明還提供了上述聚多巴胺納米球生物傳感器的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0009](I)鹽酸多巴胺在堿性溶液中15?80°C反應(yīng)2?72h，得聚多巴胺懸浮液；
[0010](2)步驟(I)制得的懸浮液在5000?20000rpm條件下離心10?30min，去除上清，沉淀加入高純水重懸；重復(fù)2?4次，沉淀烘干，得聚多巴胺納米球；
[0011](3)將濃度為0.05?lmg/mL聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為10?IOOnmol/L的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的Tris-HCl緩沖溶液按(I?9):(1?9)的體積混合，振蕩反應(yīng)10?60min,即得。
[0012]其中，步驟(I)中，所述堿性溶液為體積比為(I?9):(1?9)的水與醇的混合溶液，其PH為7.5?11，鹽酸多巴胺與堿性溶液的重量體積比為0.1?5.0mg =ImL ;或者所述堿性溶液為體積比為(I?9): (I?9)的Tris的水溶液與醇的混合溶液，其pH為7.5?10.5，Tris的水溶液濃度為5?25mmol/L ;或者所述堿性溶液為體積比為(I?9): (I?9)的Tris的水溶液與異丙醇的混合溶液，其pH為7.5?10.5, Tris的水溶液濃度為5?25mmol/L。
[0013]其中，步驟(2)中，標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸為羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的寡核苷酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0014]本發(fā)明還提供了上述聚多巴胺納米球生物傳感器在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用。
[0015]所述應(yīng)用，具體為:利用聚多巴胺納米球生物傳感器檢測(cè)DNA含量，包括以下步驟:
[0016](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；
[0017](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用緩沖溶液配制不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，將DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和聚多巴胺納米球生物傳感器溶液等體積混合，37°C下振蕩反應(yīng)30?120min ;其中，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470?495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度。
[0019]本發(fā)明還提供了上述聚多巴胺納米球生物傳感器在檢測(cè)凝血酶中的應(yīng)用。
[0020]所述應(yīng)用，具體為:利用聚多巴胺納米球生物傳感器檢測(cè)凝血酶含量，包括以下步驟:
[0021](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；
[0022](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用緩沖溶液配制不同濃度的凝血酶溶液，將凝血酶溶液和聚多巴胺納米球生物傳感器溶液等體積混合，37°C下振蕩反應(yīng)30?120min ;熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470?495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度。
[0024]有益結(jié)果:本發(fā)明提供的聚多巴胺納米球生物傳感器以聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸，利用聚多巴胺納米球優(yōu)異的熒光猝滅特性從而有效的降低背景信號(hào)可提高檢測(cè)的靈敏度，只需通過(guò)普通的熒光分光光度計(jì)就可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的采集，再通過(guò)變化表面吸附的寡核苷酸，從而大大的擴(kuò)寬了其檢測(cè)樣品范圍。該傳感器的普適性和實(shí)用性為生物分子的特異性檢測(cè)提供了一種極好的方法。
[0025]本發(fā)明利用DNA的特異性的識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)DNA的線性范圍為0.78-25nmol/L，特異性好，可以區(qū)分單堿基錯(cuò)配。
[0026]同時(shí)利用適配體的特異性的識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)凝血酶的線性范圍為0.78-37.5nmol/L，特異性好，可以避免牛血清白蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG和溶解酵素Lysozyme的干擾。
[0027]本發(fā)明提供的生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用方便快捷，在提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，能夠簡(jiǎn)化檢測(cè)過(guò)程，縮短檢測(cè)時(shí)間。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1聚多巴胺納米球的掃描電子顯微鏡圖。[0029]圖2聚多巴胺納米球的紅外譜圖。
[0030]圖3聚多巴胺納米球的拉曼譜圖。
[0031]圖4檢測(cè)DNA濃度的熒光發(fā)射譜圖(A)及信號(hào)相關(guān)性曲線(B)。
[0032]圖5檢測(cè)DNA的特異性圖。
[0033]圖6檢測(cè)凝血酶濃度的熒光發(fā)射譜圖(A)及信號(hào)相關(guān)性曲線(B)。
[0034]圖7檢測(cè)凝血酶的特異性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0036]實(shí)施例1:生物傳感器的構(gòu)建。
[0037]以直徑為300?400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有羧基熒光素的寡核苷酸，其中標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，構(gòu)建聚多巴胺納米球生物傳感器，包括以下步驟:
[0038](I)將體積比為5:2的10mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)混合溶液pH至10.3，混合溶液中加入鹽酸多巴胺，鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為Img:lmL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72h ；
[0039](2)步驟(I)得到的懸浮液,在IOOOOrpm條件下,離心IOmin,去除上清,取沉淀加入高純水重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟3次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺納米球；
[0040](3)將濃度為0.2mg/mL的聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為40nmol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸溶液按5:5的體積混合，振蕩IOmin即得。
[0041]實(shí)施例2:生物傳感器的構(gòu)建。
[0042]以直徑為300?400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有羧基熒光素的寡核苷酸，其中標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，構(gòu)建聚多巴胺納米球生物傳感器，包括以下步驟:
[0043](I)將體積比為5:2的10mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)混合溶液pH至10.3，混合溶液中加入鹽酸多巴胺，鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為Img:lmL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72h ；
[0044](2)步驟(I)得到的懸浮液，在IOOOOrpm條件下，離心lOmin，去除上清，取沉淀加入高純水重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟3次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺納米球；
[0045](3)將濃度為0.5mg/mL的聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為60nmol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸溶液按5:5的體積混合，振蕩IOmin即得，其寡核苷酸序列為:5’ -FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
[0046]實(shí)施例3:生物傳感器的構(gòu)建。
[0047]以直徑為300?400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有羧基熒光素的寡核苷酸，其中標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，構(gòu)建聚多巴胺納米球生物傳感器，包括以下步驟:[0048](I)將體積比為1:9的5mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)混合溶液pH至7.5,混合溶液中加入鹽酸多巴胺，鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為0.lmg:lmL，15°C反應(yīng) 36h ；
[0049](2)步驟(I)得到的懸浮液，在5000rpm條件下，離心30min，去除上清，取沉淀加入高純水重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟4次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺納米球；
[0050](3)將濃度為0.05mg/mL的聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為lOnmol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸溶液按9:1的體積混合，振蕩30min即得，其寡核苷酸序列為:5’ -FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
[0051]實(shí)施例4:生物傳感器的構(gòu)建。
[0052]以直徑為300?400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體吸附標(biāo)記有羧基熒光素的寡核苷酸，其中標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，構(gòu)建聚多巴胺納米球生物傳感器，包括以下步驟:
[0053](I)將體積比為9:1的25mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)混合溶液pH至
10.5，混合溶液中加入鹽酸多巴胺，鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為5.0mg:lmL,80°C反應(yīng) 2h ；
[0054](2)步驟(I)得到的懸浮液,在20000rpm條件下,離心20min,去除上清,取沉淀加入高純水重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟2次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺納米球；
[0055](3)將濃度為lmg/mL的聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為100nmol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸溶液按1:9的體積混合，振蕩60min即得，其寡核苷酸序列為:5’ -FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
[0056]實(shí)施例5
[0057]與實(shí)施例3基本相同，不同之處僅在于:步驟(I)中，采用體積比為1:9的水與異丙醇混合代替體積比為1:9的5mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)pH至7.5,鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為0.1mg:lmL。
[0058]實(shí)施例6
[0059]與實(shí)施例4基本相同，不同之處僅在于:步驟(I)中，采用體積比為9:1的水與異丙醇混合代替體積比為9:1的25mmol/L的Tris溶液與異丙醇混合,調(diào)pH至11鹽酸多巴胺與混合溶液的重量體積比為5.0mg:lmL。
[0060]實(shí)施例7
[0061]利用實(shí)施例1制得的生物傳感器檢測(cè)DNA含量，包括如下步驟:
[0062](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；
[0063](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液與所述的聚多巴胺納米球生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為200yL，37°C下振蕩反應(yīng)60min，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0064](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4。[0065]實(shí)施例8
[0066]利用實(shí)施例2制得的生物傳感器檢測(cè)DNA特異性，包括如下步驟:
[0067](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；
[0068](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的對(duì)照DNA樣品溶液與所述的聚多巴胺納米球生物傳感器器的溶液等體積混合，體積分別為200μ L，37°C下振蕩反應(yīng)120min，對(duì)照DNA樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:3、SEQ IDNo:4、SEQ ID No:5所示。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，
[0069]熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0070](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0071]實(shí)施例9
[0072]利用實(shí)施例3制得的生物傳感器檢測(cè)DNA含量，包括如下步驟:
[0073](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含50mmol/L氯化鈉,0.5mmol/L氯化鉀,0.2mmol/L氯化鎂和0.2mmol/L氯化隹丐；
[0074](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液與所述的聚多巴胺納米球生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為200yL，37°C下振蕩反應(yīng)30min，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0075](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度。
[0076]實(shí)施例10
[0077]利用實(shí)施例5制得的生物傳感器檢測(cè)DNA含量，包括如下步驟:
[0078](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含200mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；
[0079](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液與所述的聚多巴胺納米球生物傳感器器的溶液等體積混合，體積分別為200μ L，37°C下振蕩反應(yīng)120min, DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0080]熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為450納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0081](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度。
[0082]實(shí)施例11
[0083]利用實(shí)施例4制得的生物傳感器檢測(cè)凝血酶含量，包括如下步驟:
[0084](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化隹丐；[0085](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的凝血酶溶液與所述的生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為200 μ L，37°C下振蕩反應(yīng)60min。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0086](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0087]實(shí)施例12
[0088]利用實(shí)施6制得的生物傳感器檢測(cè)凝血酶特異性，包括如下步驟:
[0089](I)配制溶液:緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含140mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化?丐；。
[0090](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的對(duì)照樣品溶液與所述的生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為20(^匕371:下振蕩反應(yīng)601^11，對(duì)照樣品分別為:牛血清白蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG、溶解酵素Lysozyme。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0091](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度，結(jié)果見(jiàn)圖7。
[0092]實(shí)施例1 3
[0093]利用實(shí)施例1制得的生物傳感器檢測(cè)凝血酶含量，包括如下步驟:
[0094](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含50mmol/L氯化鈉,0.5mmol/L氯化鉀,0.2mmol/L氯化鎂和lmmol/L氯化鈣；
[0095](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的凝血酶溶液與所述的生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為200 μ L，37°C下振蕩反應(yīng)30min。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為480納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0096](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度。
[0097]實(shí)施例14
[0098]利用實(shí)施例6制得的生物傳感器檢測(cè)凝血酶含量，包括如下步驟:
[0099](I)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含200mmol/L氯化鈉,5mmol/L氯化鉀，lmmol/L氯化鎂和0.2mmol/L氯化鈣；
[0100](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將用緩沖溶液配制的不同濃度的凝血酶溶液與所述的生物傳感器的溶液等體積混合，體積分別為200yL，37°C下振蕩反應(yīng)120min。熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0101](3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其特征在于:以直徑為40~400nm的聚多巴胺納米球?yàn)檩d體，聚多巴胺納米球的表面吸附標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其特征在于:所述聚多巴胺納米球的直徑為300~400nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其特征在于:所述熒光分子為羧基熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚多巴胺納米球生物傳感器，其特征在于:所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的聚多巴胺納米球生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)鹽酸多巴胺在堿性溶液中15~80°C反應(yīng)2~72h，得聚多巴胺懸浮液； (2)步驟(1)制得的懸浮液在5000~20000rpm條件下離心10~30min，去除上清，沉淀加入高純水重懸；重復(fù)2~4次，沉淀烘干，得聚多巴胺納米球； (3)將濃度為0.05~lmg/mL聚多巴胺納米球的水溶液和濃度為10~lOOnmol/L的標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸的Tris-HCl緩沖溶液按(1~9): (1~9)的體積混合，振蕩反應(yīng)10~60min,即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中，所述堿性溶液為體積比為(1~9): (1~9)的水與醇的混合溶液，其pH為7.5~11，鹽酸多巴胺與堿性溶液的重量體積比為0.1~5.0mg:lmL ;或者所述堿性溶液為體積比為(I~9): (I~9)的Tris的水溶液與醇的混合溶液，其pH為7.5~10.5, Tris的水溶液濃度為5~25mmol/L ;優(yōu)選地，所述堿性溶液為體積比為(1~9): (1~9)的Tris的水溶液與異丙醇的混合溶液，其pH為7.5~10.5，Tris的水溶液濃度為5~25mmol/L ;步驟(2)中，標(biāo)記有熒光分子的寡核苷酸為羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的寡核苷酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的聚多巴胺納米球生物傳感器在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:利用聚多巴胺納米球生物傳感器檢測(cè)DNA含量，包括以下步驟: (1)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含50~200mmol/L氯化鈉,0.5~5mmol/L氯化鉀,0.2~lmmol/L氯化鎂和0.2~lmmol/L氯化鈣； (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用緩沖溶液配制不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，將DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和聚多巴胺納米球生物傳感器溶液等體積混合，37°C下振蕩反應(yīng)30~120min ;其中，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470~495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)含量測(cè)定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)DNA樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)DNA樣品中DNA的濃度。
9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的聚多巴胺納米球生物傳感器在檢測(cè)凝血酶中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:利用聚多巴胺納米球生物傳感器檢測(cè)凝血酶含量，包括以下步驟: (1)緩沖溶液配制:配制20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，其pH為7.4，含50~200mmol/L氯化鈉,0.5~5mmol/L氯化鉀,0.2~lmmol/L氯化鎂和0.2~lmmol/L氯化鈣； (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用緩沖溶液配制不同濃度的凝血酶溶液，將凝血酶溶液和聚多巴胺納米球生物傳感器溶液等體積混合，37°C下振蕩反應(yīng)30~120min ;熒光分光光度法分別測(cè)定各溶液的熒光發(fā)射圖譜，熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為470~495納米，發(fā)射圖譜的波長(zhǎng)范圍為500-650納米，根據(jù)不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰的強(qiáng)度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)含量測(cè) 定:采用與步驟(2)相同的方法，測(cè)定待測(cè)凝血酶樣品發(fā)射峰的強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得待測(cè)凝血酶樣品中凝血酶的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/545GK103884838SQ201410127769
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】許丹科, 羌維兵, 李偉, 李曉青, 陳翔 申請(qǐng)人:南京大學(xué)