一種單個抗體分子原子力顯微鏡成像的樣品制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種單個抗體分子原子力顯微鏡成像的樣品制備方法、一種單個抗體分子IgG的原子力顯微鏡成像方法和一種結(jié)合有抗體分子IgG的DNA折紙。
【背景技術(shù)】
[0002]原子力顯微術(shù)(AFM)是在納米尺度上研究生物分子的重要工具之一。因為具有可在近生理條件下對生物分子進行納米水平的成像，獲得高清的分子形貌特征的特點，已經(jīng)成為目前研究生物分子結(jié)構(gòu)和功能不可替代的研究手段。
[0003]抗體是一類重要的生物分子，它具有中和毒素和病毒，促進吞噬細胞吞噬的功能，且可介導(dǎo)免疫細胞活性，激化補體，在疾病的預(yù)防、診斷和治療中都起到了非常重要的作用。抗體的功能來源于抗體特殊的分子結(jié)構(gòu)，利用分子模擬、X射線晶體衍射和電子顯微鏡等方法，獲得了抗體IgG分子“Y”和“T”型的基本結(jié)構(gòu)特征。Zhifeng Shao和Danie IM.Czajkowsky等人采用冷凍AFM的方法，獲得了抗體IgG和IgM的高分辨圖像，首次觀察到了分散的單個IgG抗體分子;Alvaro San Paulo等人采用AFM特殊的吸引力區(qū)成像模式，得到了空氣環(huán)境中吸附在云母表面上抗體“Y”形圖像。但通過上述方法對單個抗體分子IgG進行原子力顯微鏡成像時樣品的制備方法較為復(fù)雜，成像時對儀器設(shè)備要求較高，例如需要特殊的低溫模塊和裝置，并且最終難以獲得理想的單個抗體分子IgG的AFM圖像。因此目前尚缺少一種操作簡單、成像效果清晰的單個抗體分子IgG的AFM成像的樣品制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中針對單個抗體分子的原子力顯微鏡成像的樣品制備方法較為復(fù)雜、且最終的單個抗體分子IgG的成像效果不夠理想的問題，提供了一種單個抗體分子IgG原子力顯微鏡成像的樣品制備方法。本發(fā)明的樣品制備方法將AFM與DNA納米折紙技術(shù)相結(jié)合，操作簡便，制備得到的單個抗體分子IgG的樣品在液體環(huán)境下借助DNA折紙將抗體分子IgG吸附在云母表面上，由于避免了固液界面毛細力作用在抗體分子IgG上，在成像時受到的作用力可降低到極小的水平，減少了針尖效應(yīng)對抗體分子IgG結(jié)構(gòu)的影響，使得成像時測定的數(shù)據(jù)更加準確，與樣品實際形貌特征相符性更好，成像效果更清晰。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題:
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案之一:一種單個抗體分子IgG原子力顯微鏡成像的樣品的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0007](I)將邊上偶聯(lián)有小分子抗原的DNA折紙與所述小分子抗原的抗體混合、反應(yīng);所述小分子抗原包括偶聯(lián)在所述DNA折紙的邊上、相互之間距離為8?15nm的2個相同的小分子；
[0008](2)將步驟(I)反應(yīng)所得的產(chǎn)物滴加到新解離的云母片上，吸附、上鏡、添加緩沖液，即制得所述單個抗體分子IgG的原子力顯微鏡成像的樣品。
[0009]本發(fā)明中，步驟(I)為:將邊上偶聯(lián)有小分子抗原的DNA折紙與所述小分子抗原的抗體混合、反應(yīng);所述小分子抗原包括偶聯(lián)在所述DNA折紙的邊上、相互之間距離為8?15nm的2個相同的小分子。
[0010]所述小分子抗原在所述DNA折紙每邊上的數(shù)量可以為常規(guī)的數(shù)量，如I個以上，較佳地為每邊2?3個，更佳地為3個。所述小分子抗原的分子量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的小分子的分子量，較佳地為200?lOOODa，更佳地為780Da。所述小分子抗原可以為本領(lǐng)域常規(guī)的小分子，例如熒光分子、生物素、地高辛、多肽等。所述小分子抗原包括距離為8?15nm的2個相同的小分子，較佳地包括距離為10?15nm的2個相同的小分子。
[0011]本發(fā)明中，所述DNA折紙可以為本領(lǐng)域常規(guī)的DNA折紙，包括各種不同形狀的DNA折紙，如矩形或等邊三角形DNA折紙。所述DNA折紙的邊長可以為本領(lǐng)域常規(guī)的長度，較佳地為70?130nm，更佳地為100?130nm，最佳地為130nm。所述DNA折紙可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進行組裝，較佳地由單鏈腳手架DNA和訂書釘單鏈DNA自組裝形成，所述訂書釘單鏈DNA用于固定所述單鏈腳手架鏈DNA形成目標圖形。所述單鏈腳手架鏈DNA可以為本領(lǐng)域常規(guī)的單鏈腳手架鏈DNA，較佳地為Ml 3mp 18。
[0012]在一較佳的實施方案中，所述DNA折紙的組裝方法包括以下步驟:將單鏈腳手架鏈DNA Ml3mp18與所述訂書釘鏈DNA混合于TAE-Mg2+緩沖體系，從95 °C退火至20 °C，退火速率為0.l°C/10s，制得所述DNA折紙；所述TAE-Mg2+緩沖液為40mM Tris-乙酸、ImM EDTA、12.5mMMgCl2,pH8.0 ο
[0013]在一更佳的實施方案中，所述DNA折紙的組裝方法還包括以下步驟:純化得到的所述DNA折紙。所述純化可以為本領(lǐng)域常規(guī)的純化DNA折紙的方法，較佳地為超濾所述DNA折紙，例如將所述DNA折紙在冷凍離心機中15°C，3000g超濾15分鐘后，棄去含有多余短鏈的廢液，重新加入I XTAE/Mg2+緩沖液定容后15°C，100g超濾10分鐘即得經(jīng)超濾純化的DNA折紙。
[0014]當(dāng)所述DNA折紙的性狀為等邊三角形時，所述訂書釘單鏈DNA的核苷酸序列較佳地為2010年3月17日發(fā)表在J.Am.Chem.Soc.第132卷第10期第3248-3249頁的題為Goldnanoparticle self-similar chain structure organized by DNA origami的論文的Supporting Online Informat1n中的SI 1-S16頁所記載的從AOl至Loop的DNA序列，偶聯(lián)有小分子的堿基較佳地為序列428、431、408、437、465、463、828、831、808、837、865、863、028、C31、C08、C37、C65和C63的5’末端的堿基。當(dāng)所述DNA折紙的性狀為矩形時，所述訂書釘單鏈DNA的核苷酸序列較佳地為2008年I月11日發(fā)表在Science第319卷第5860期第180-183頁的題為Self-Assembled Water-Soluble Nucleic Acid Probe Tiles for Label-Free RNAHybridizat1n Assays的論文中的補充材料第SI5-S19頁所記載的從I至216的DNA序列，偶聯(lián)有小分子的堿基較佳地為序列1、132、52、76、75、99、181、205、204和180的5’末端堿基。
[0015]所述小分子抗原的抗體和所述偶聯(lián)有小分子抗原的DNA折紙的摩爾比可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例，較佳地為1:1。
[0016]所述反應(yīng)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的抗原與抗體的免疫反應(yīng)，所述反應(yīng)的溫度可以為本領(lǐng)域抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)常規(guī)的溫度，較佳地為4°C?25 °C，更佳地為25 °C。所述反應(yīng)的時間可以為本領(lǐng)域抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)常規(guī)的時長，較佳地為0.5h?8h，更佳地為8h。在一較佳的實施方案中，所述反應(yīng)的條件為25°C溫育0.5h。在另一較佳的實施方案中，所述反應(yīng)的條件為4°C溫育8h。
[0017]本發(fā)明中，步驟(2)為:將步驟(I)反應(yīng)所得的產(chǎn)物滴加到新解離的云母片上，吸附、上鏡、添加緩沖液，即制得所述單個抗體分子IgG的原子力顯微鏡成像的樣品。
[0018]步驟(2)中，所述步驟(I)反應(yīng)所得的產(chǎn)物的體積可以為原子力顯微鏡檢測操作中常規(guī)的加樣體積，較佳地為3?5yL。所述新解離的云母片為原子力顯微鏡常用的襯底。所述吸附的時間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時長，較佳地為3min。所述緩沖液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的緩沖液，如TAE或TBE緩沖液，較佳地為TAE緩沖液。所述添加緩沖液的體積可以為原子力顯微鏡領(lǐng)域常規(guī)的鏡檢體積，較佳地為30yL。
[0019]本發(fā)明提供了一優(yōu)選的實施方案，其包括以下步驟:
[0020]I)將單鏈腳手架鏈D