用于掃描檢測(cè)的方法和設(shè)備的制造方法
【專利說(shuō)明】用于掃描檢測(cè)的方法和設(shè)備
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002]本申請(qǐng)要求2013年9月30日提交的且標(biāo)題為用于空時(shí)3D檢測(cè)的電導(dǎo)測(cè)定和光學(xué)方法的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/884，365號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容出于所有目的而以引用的方式并入本文中。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助研究或發(fā)展的聲明
[0004]本發(fā)明是在國(guó)家航空航天局授予的授權(quán)編號(hào)NNX11A066G下借助政府支持而制造。政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明大體上涉及一種用于檢測(cè)分析物的洗脫或?qū)崟r(shí)地分析沿著色譜柱移動(dòng)的樣本的設(shè)備和方法。所述設(shè)備包括可移動(dòng)地安裝在底座上以用于沿著色譜柱來(lái)回掃描以便提供關(guān)于所需分析物的洗脫的實(shí)時(shí)信息的檢測(cè)器。還提供一種使用本發(fā)明的設(shè)備來(lái)檢測(cè)所需分析物的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]液相柱狀分離屬于用于當(dāng)今分析化學(xué)家的骨干技術(shù)。毛細(xì)管電泳(CE)和尤其高效液相色譜法(HPLC)是兩個(gè)主要實(shí)例。在任一實(shí)例中，通過(guò)流動(dòng)通過(guò)管狀導(dǎo)管的栗送的洗脫劑(例如，HPLC)或通過(guò)施加跨越管的長(zhǎng)度施加的電場(chǎng)(例如，CE)來(lái)在所述導(dǎo)管的一端處注入樣本并使其朝向所述導(dǎo)管的出口移動(dòng)。檢測(cè)器定位成朝向?qū)Ч艿囊欢?CE、毛細(xì)管HPLC)或緊接在導(dǎo)管之后。樣本中的不同成分的分離是因?yàn)樗鼈円圆煌俾室苿?dòng)通過(guò)柱且在不同時(shí)間到達(dá)檢測(cè)器而實(shí)現(xiàn)。
[0007]特別是在HPLC中，為了實(shí)現(xiàn)具有時(shí)間效率的分離和靈敏的檢測(cè)，使用稱作梯度洗脫的技術(shù)，尤其是在樣本含有弱保留(快速移動(dòng)的)物種(的群組)和強(qiáng)保留物種(的群組)時(shí)。在這種情況下，在分離的初始階段期間使用弱洗脫劑(低推動(dòng)力)，使得在不同的弱保留物種之間實(shí)現(xiàn)分離。接著增加洗脫劑強(qiáng)度以洗脫強(qiáng)保持物種并實(shí)現(xiàn)其之間的分離。如果全程使用弱洗脫劑，那么強(qiáng)保持分析物將花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)洗脫(如果其完全洗脫的話)且所得高峰將非常寬，從而使靈敏的檢測(cè)變得困難。如果全程使用強(qiáng)洗脫劑，那么弱保留物種將作為群組一起洗脫而不進(jìn)行區(qū)分。
[0008]存在許多模擬上述分離的程序，包含本發(fā)明者最近開(kāi)發(fā)的程序。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)
(23)。此類模擬和實(shí)際生活實(shí)驗(yàn)指示:即使在等梯度(S卩，不涉及梯度)的情況下，分析物的分離也經(jīng)常在分析物到達(dá)終端檢測(cè)器之前很久完成，不僅浪費(fèi)了時(shí)間，而且譜帶在其余時(shí)間內(nèi)加寬且檢測(cè)靈敏度減小。在梯度洗脫中，以下情況并不罕見(jiàn):如果強(qiáng)洗脫劑濃度增加得太快，那么在駐留于柱上時(shí)分離的一對(duì)弱保留物種最終被推動(dòng)至一個(gè)未區(qū)分的高峰。很少通過(guò)推理方式處理挑選特定臨時(shí)梯度程序，而是試圖對(duì)此進(jìn)行微調(diào)以作為不同組成物的若干連續(xù)嘗試的結(jié)果。
[0009]諷刺的是，當(dāng)MikhaiITswett首先發(fā)明色譜法時(shí)，他在用CaCO3填充的玻璃柱上分離出植物色素且他能夠真實(shí)地觀察他的分離。盡管無(wú)可否認(rèn)他在他的時(shí)代沒(méi)有任何方法來(lái)量化柱上的譜帶。原則上，如果你不僅能以定性的方式，而且以定量的方式以優(yōu)良的靈敏度看見(jiàn)分離，那么無(wú)需等待直到端柱檢測(cè)器看見(jiàn)洗脫的譜帶。事實(shí)上，如果我們可以近實(shí)時(shí)地看見(jiàn)分離，那么其可同時(shí)更改洗脫條件以實(shí)現(xiàn)最佳分離和最靈敏的可能量化。
[0010]在分離過(guò)程期間的所有時(shí)間存在于柱中的不同位置的內(nèi)容的定量檢測(cè)/成像的概念并不是新的。就本發(fā)明者所知，術(shù)語(yǔ)“全柱檢測(cè)”(WCD)首先由Birks和他在理論模擬方面的學(xué)生創(chuàng)造。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(I)。在具有終端分離后檢測(cè)布置的傳統(tǒng)色譜法中，獨(dú)立于任何特定檢測(cè)器的分析物的唯一識(shí)別標(biāo)記是終端保持時(shí)間，經(jīng)常依據(jù)其“保持因子”予以描述。應(yīng)注意，光譜特性和有時(shí)用于識(shí)別的此類其它特性并不是色譜法固有的，信息是檢測(cè)器特定的。
[0011]明顯地，為了執(zhí)行全柱檢測(cè)，檢測(cè)器必須能夠“看穿”柱的圍墻。早在1968年，Brumbaugh和Ackers描述“掃描凝膠色譜法”，其中使柱移動(dòng)經(jīng)過(guò)固定光源-檢測(cè)器配置且能夠監(jiān)測(cè)在凝膠柱的整個(gè)長(zhǎng)度上的分子篩分離的吸收度分布。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(2)。以前，移動(dòng)HPLC柱(如今的栗和注入器一體地附接至HPLC柱)并不非常實(shí)用。在其第一實(shí)驗(yàn)論文中，Birk和他的學(xué)生使用金屬包覆的玻璃柱、一側(cè)上的在365nm下發(fā)射的長(zhǎng)熒光燈和金屬包覆物中的14對(duì)彼此相對(duì)的孔:光在一側(cè)上進(jìn)入且用另一側(cè)上的14個(gè)個(gè)別光電二極管予以檢測(cè)。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(3)。
[0012]盡管許多理論預(yù)測(cè)和保持因子在梯度條件下如何改變的闡明可用沿著柱的14個(gè)點(diǎn)的最大分辨率加以驗(yàn)證和示范，但性能和結(jié)果的準(zhǔn)確度低于預(yù)期。
[0013]Pawliszyn在檢測(cè)毛細(xì)管中的折射率改變時(shí)使用他的大量的先前經(jīng)驗(yàn)以在毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)分析系統(tǒng)中的15mm的有效長(zhǎng)度上設(shè)計(jì)折射率梯度檢測(cè)系統(tǒng)。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(4)。使用固定聚焦He-Ne激光源。光束由毛細(xì)管之后的透鏡擴(kuò)展，使得毛細(xì)管上的距離在檢測(cè)器平面中放大10倍，其中掃描距離是150_而解析度是0.1mm(適應(yīng)注射栗驅(qū)動(dòng))，從而在15mm的整個(gè)分離距離上提供1500點(diǎn)分辨率。因?yàn)椴豢赡馨纯焖匐娪痉蛛x所需的足夠速度來(lái)移動(dòng)單個(gè)檢測(cè)器光電二極管，所以其借助128元件光電二極管陣列對(duì)分離毛細(xì)管的較小的(3mm)長(zhǎng)度成像。較寬的光電二極管陣列本將允許對(duì)分離毛細(xì)管的較長(zhǎng)部分成像，且可免除移動(dòng)的光電二極管。這恰好在1994年借助氬離子激光源和1024元件C⑶檢測(cè)器-對(duì)25mm的毛細(xì)管(分辨率明顯是1024個(gè)點(diǎn))成像的25mm寬的檢測(cè)器進(jìn)行。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(5);也見(jiàn)美國(guó)專利第5，395，502號(hào)。
[0014]與上文相同的概念由Beale和Sudmeier在1995年改編以用于具有激光誘導(dǎo)熒光性(LIF)檢測(cè)的CE或CIEF。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(6)。他們?cè)陔妱?dòng)平移臺(tái)上放置整個(gè)分離毛細(xì)管(最大速度50mm/s)，高達(dá)19cm的長(zhǎng)度可在顯微鏡物鏡的視場(chǎng)下C3LIF系統(tǒng)在共焦模式中操作。其用去除了聚酰亞胺涂層的常規(guī)毛細(xì)管(具有發(fā)煙硫酸或丁烷火炬)獲得比具有UV透明涂層的硅石毛細(xì)管更好的結(jié)果。他們注意到，在內(nèi)孔<75μπι的情況下，其變得非常難以在毛細(xì)管內(nèi)維持激光聚焦，這極大地減小信噪比(S/N)。
[0015]也應(yīng)注意，很少物質(zhì)具有自體熒光性。依賴于LIF的任何分析系統(tǒng)必須經(jīng)歷先前衍生作用。沒(méi)有合適的衍生化學(xué)可存在;至少，這表示額外棘手步驟。熒光性在重復(fù)掃描下的光致褪色也是一個(gè)問(wèn)題，尤其是對(duì)于強(qiáng)光源。
[0016]在1996年，Preisler和Yeung用Ar激光和平凸鏡照明232mm的毛細(xì)管。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(7)。通過(guò)配備有適當(dāng)?shù)陌l(fā)射濾光器的垂直安裝的578元件CCD陣列監(jiān)測(cè)整個(gè)照明的區(qū)域。
[0017]其僅監(jiān)測(cè)熒光帶/正面的移動(dòng)以確定流動(dòng)速度，但原則上，這將允許在已概述警告的情況下監(jiān)測(cè)可被制造以借助特定激光源發(fā)熒光的分析物的分離。在此之前，在1994年，布置由Wu和Pawliszyn示范，其中輸入光由光纖陣列耦合至毛細(xì)管，但靈敏度較差，這是因?yàn)楣怦詈喜⒉桓咝АＲ?jiàn)以下參考文獻(xiàn)(4)。
[0018]在1998年，基于PawiIszyn的作品，加拿大的Convergent B1sciences使成像CIEF檢測(cè)系統(tǒng)商業(yè)化，所述系統(tǒng)使用光纖陣列來(lái)使280nm的UV光從氙氣燈進(jìn)入具有寬為50μπι且長(zhǎng)為5cm的孔隙的毛細(xì)管盒中。
[0019]透射光由CCD陣列讀取。此儀器(iCE280)仍如此且作為較精心設(shè)計(jì)的iCE3系統(tǒng)的部分銷售。
[0020]在2001年，在其評(píng)審CE和CIEF中的成像檢測(cè)時(shí)，Wu等人概述了那個(gè)時(shí)代的領(lǐng)域的狀態(tài)。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(8)。論文中示出照明和檢測(cè)的受喜愛(ài)的一般布置，無(wú)論是通過(guò)透射率還是熒光性;iCE280布置不在此類別中。
[0021]相信iCE280是迄今為止供應(yīng)全柱或成像檢測(cè)的唯一商業(yè)儀器，且其理想地僅適合于總分離距離較小(例如，對(duì)于iCE280是5cm)時(shí)。這可適用于CIEF中，但存在很少可接受此的其它技術(shù)。
[0022]完全不同的方法是可能的，其中液芯波導(dǎo)(LCW)用于吸收度和熒光性檢測(cè)。LCW是管子或?qū)Ч?，其中壁由皆在所關(guān)注波長(zhǎng)區(qū)中光學(xué)上透明的材料組成。
[0023]光可以相對(duì)小的損耗進(jìn)行通過(guò)長(zhǎng)的LCW毛細(xì)管。如果此類毛細(xì)管被軸向地照明并監(jiān)測(cè)穿過(guò)毛細(xì)管的整個(gè)長(zhǎng)度的光，那么只要注入樣本，光透射就會(huì)因?yàn)闃颖局写嬖诘墓馕战M分而下降。信號(hào)將保持不變，直到最早的洗脫組分離開(kāi)檢測(cè)路徑-透射光將升高那個(gè)量。如果將此數(shù)據(jù)描繪為吸收度對(duì)時(shí)間，那么輸出將類似于向下的臺(tái)階情況，其中從每一階到另一階的過(guò)渡描繪分析物的洗脫。較常規(guī)的色譜圖或電泳圖可通過(guò)按時(shí)間區(qū)分信號(hào)來(lái)獲得。
[0024]盡管此概念是用常規(guī)毛細(xì)管(其損失更多光，見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)9)予以示范，但過(guò)程借助LCW毛細(xì)管(見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)10)變得更實(shí)用。然而，此系統(tǒng)具有眾多困難。盡管大的吸收高峰可完全分離，但其在信號(hào)中一起出現(xiàn)。如果小的首先洗脫，那么其量化準(zhǔn)確度受將一個(gè)大數(shù)從另一大數(shù)減去的需要的限制。區(qū)分放大噪聲。許多時(shí)間檢測(cè)是用光路徑中的許多吸收組分完成的，這減少光通過(guò)量并增加檢測(cè)器噪聲。
[0025]借助液芯波導(dǎo)管進(jìn)行的熒光性檢測(cè)具有更多可能性。如果激發(fā)光徑向地入射在毛細(xì)管上，那么未吸收的入射輻射主要通過(guò)壁傳出。相比之下，發(fā)射的熒光的很大部分沿著管子向下進(jìn)行，其中其可由耦合至光電檢測(cè)器的光纖或直接由光電檢測(cè)器拾取。見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)(11)和(12)。
[0026]替代于試圖沿著其長(zhǎng)度均勻地照明管子，可沿著分離毛細(xì)管掃描(通過(guò)空間或由光纖耦合)激光束