一種檢測(cè)養(yǎng)殖廢物中雌激素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)養(yǎng)殖廢物中雌激素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境激素污染被認(rèn)為繼臭氧層破壞、溫室效應(yīng)之后的第三大全球性重大環(huán)境問(wèn)題。環(huán)境激素定義為對(duì)生物的正常行為及生殖、發(fā)育相關(guān)的正常激素的合成、儲(chǔ)存、分泌、體內(nèi)輸送、結(jié)合及清除等過(guò)程產(chǎn)生妨礙作用的物質(zhì)。環(huán)境激素的被認(rèn)為是導(dǎo)致男性精子數(shù)量減少、精子畸形，女性不孕不育現(xiàn)象的主要因素，也和成人類(lèi)免疫系統(tǒng)功能下降，內(nèi)分泌異常，惡性腫瘤增多，神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，新生兒畸形，發(fā)育不全等疾病逐年上升密切相關(guān)。同時(shí)，環(huán)境激素能夠影響野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，從而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成威脅。環(huán)境激素污染和人類(lèi)活動(dòng)密切相關(guān)。生活污水和養(yǎng)殖廢棄物被認(rèn)為是環(huán)境激素的主要來(lái)源。目前最受關(guān)注的激素主要是雌激素，包括雌二醇，炔雌醇，雌酮，雙酚A等。生活污水和養(yǎng)殖廢棄物的排放是它們進(jìn)入環(huán)境的主要途徑。
[0003]隨著對(duì)環(huán)境激素危害的認(rèn)識(shí)，建立高效、可靠的分析方法迫在眉睫。環(huán)境激素污染的特點(diǎn)是:第一，分布廣泛，在各種介質(zhì)，包括水體、土壤、生物樣品中均可能存在；第二，濃度低，通常在ng/L水平，但由于激素自身的特點(diǎn)，即使在這樣的低濃度，也能產(chǎn)生顯著的生物效應(yīng)。目前，雌激素的分析主要通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)(HPLC/MS/MS)技術(shù)，普通液相色譜-紫外檢測(cè)(HPLC/DAD)的靈敏度難以滿(mǎn)足要求。相對(duì)于普通的HPLC/DAD的廣泛應(yīng)用，HPLC/MS/MS屬于高端精密儀器，成本高，對(duì)操作人員的要求也高，一般分析實(shí)驗(yàn)室不具備。除此之外，HPLC/MS/MS分析對(duì)樣品前處理有很高的要求。對(duì)于水樣，首先要經(jīng)過(guò)固相萃取(SPE)富集，然后要進(jìn)行復(fù)雜的凈化處理，才可以進(jìn)HPLC/MS/MS分析。凈化的目的是盡可能去除樣品中的各種雜質(zhì)，否則會(huì)對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性?？傊?，環(huán)境激素的定量分析步驟繁瑣、耗時(shí)，對(duì)人員和儀器要求很高，經(jīng)濟(jì)成本也很高。
[0004]水中環(huán)境激素的分析方法已經(jīng)相對(duì)成熟。養(yǎng)殖廢棄物的排放和還田是環(huán)境中激素的主要來(lái)源之一。相對(duì)于水樣，養(yǎng)殖廢棄物的成分要復(fù)雜的多，尤其含有一定量的油脂。雌激素親水性不強(qiáng)，用水提取回收率很低，因此必須用有機(jī)溶劑，但何種溶劑合適，目前還不清楚。此外，有機(jī)溶劑在提取激素的過(guò)程中，會(huì)同時(shí)把樣品中的油脂提取出來(lái)。油脂進(jìn)入無(wú)論對(duì)后面的高效液相色譜分離，還是質(zhì)譜分析，都是致命的。以上種種因素，對(duì)于養(yǎng)殖廢棄物中的激素物質(zhì)，目前還沒(méi)有可靠的提取、分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種養(yǎng)殖固體廢棄物(如養(yǎng)雞場(chǎng)、養(yǎng)豬場(chǎng)包括糞便、絨毛、食物殘?jiān)?中雌二醇，炔雌醇，雌酮，雙酚A等雌激素的定量分析方法，該方法能夠有效克服樣品中各種雜質(zhì)的干擾，同時(shí)成本相對(duì)低廉，適合大批量樣品的分析。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種檢測(cè)養(yǎng)殖廢物中雌激素的方法，其特征在于該方法包括以下步驟:
[0008](I)樣品萃取:取養(yǎng)殖場(chǎng)固體廢物3-10g，以體積比為2:1-4:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液為溶劑，在超聲輔助下萃取，合并萃取液，離心，取上清液，用氮?dú)獯等軇┦怪畵]發(fā)，直至剩余溶液l_2mL ;
[0009](2)樣品凈化:取硅膠2_5g，用正己烷活化，裝入徑高比為1:10-15的玻璃柱中，靜置，待固體沉降完全，排放正己烷，使其液面和硅膠柱齊平，制備得到凈化小柱；玻璃柱徑高比優(yōu)選為I:10 ；
[0010]將步驟(I)得到的樣品用正己烷溶解，再上載到凈化小柱，用正己烷清洗，然后用氮?dú)鈱⑼弈z柱吹干；
[0011](3)樣品洗脫:用乙腈洗脫，收集洗脫液，濃縮至l_2ml ;
[0012](4)樣品測(cè)定:用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量分析，熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和310nm。
[0013]該方法中二氯甲烷和甲醇的混合溶液體的積比優(yōu)選為2:1。
[0014]上述方法步驟(I)中所述的萃取條件為萃取2-3次，每次萃取5-15分鐘。
[0015]上述方法步驟(2)所用的硅膠粒徑為過(guò)80-100目篩。所述的玻璃柱優(yōu)選直徑1cm，柱長(zhǎng) 10_15cm。
[0016]上述方法步驟⑵中樣品用10_20mL正己烷溶解，然后上載到凈化小柱，另外再用30mL正己烷清洗，然后用氮?dú)鈱⒐枘z柱吹干。所用的正己烷的用量為10-20ml，油脂作為非極性物質(zhì)，很容易被正己烷洗掉，而雌激素有一定極性，基本被硅膠吸附保留。
[0017]上述方法步驟(3)所用的乙腈用量為2_5mL，可將殘留在硅膠柱上的雌激素用乙腈洗脫下來(lái)。
[0018]上述方法步驟(2)硅膠用正己烷活化的具體步驟是將硅膠中加入正己烷攪拌糊狀再倒入玻璃柱。
[0019]由于雌二醇，炔雌醇，雌酮，雙酚A等等雌激素分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似，有相近的熒光特性，可以用熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析，上述方法步驟(4)高效液相色譜-熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析時(shí)采用色譜柱為C18反相柱，流動(dòng)相為甲醇和水，流速lmL/min，采用梯度洗脫，甲醇初始濃度為30%，在15分鐘內(nèi)升高到50%并保持10分鐘，然后再在10分鐘內(nèi)繼續(xù)升高到100%，并保持5分鐘。
[0020]本發(fā)明采用樣品凈化的主要目的是去除其中的油性物質(zhì)，以避免對(duì)后續(xù)的儀器分析產(chǎn)生影響，是關(guān)鍵步驟。凈化在凈化小柱上完成。凈化小柱優(yōu)選為玻璃材質(zhì)，徑高比最好為1:10，下面有活塞可以控制溶劑流出。填充物為80-100目硅膠，硅膠加入正己烷攪拌糊狀倒入玻璃柱，靜置，待固體沉降，注意硅膠柱中間不能留有氣泡。打開(kāi)下面的活塞，排放正己烷，使其液面和硅膠柱齊平。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果:
[0022](I) 二氯甲烷/甲醇混合溶劑有效提取養(yǎng)殖固體廢棄物中的雌激素，回收率在80%以上。
[0023](2)本發(fā)明采用硅膠小柱可以有效去除樣品中的大量油脂類(lèi)物質(zhì)。
[0024](3)運(yùn)用HPLC/FL分析，相對(duì)HPLC/MS/MS，儀器相對(duì)便宜、普遍，