法對各樣品進行測試。
[0044] 總蛋白含量檢測：按《中國藥典》三部附錄，"蛋白質測定法"中的"Lowry法"檢測牛 血清樣品中的總蛋白含量。
[0045] 白蛋白含量檢測：
[0046] 凝膠的配制:分離膠凝膠濃度為15%，濃縮膠凝膠濃度為4.5%。
[0047]加樣:使用BIO-RAD MINI 2電泳槽和10孔樣品梳;待濃縮膠聚合后拔去樣品梳，加 入牛血清樣品，每孔加樣20yL。
[0048] 電泳及染色:接通電源，開始電泳;待電泳結束后，使用考馬斯亮藍法過夜染色后， 取出脫色，直至凝膠底色幾乎無色。
[0049] 掃描及分析:使用BI0-RAD光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer對電 泳膠片進行掃描后，使用分析軟件"Quantity One"中的條帶分析方法"Band Attributes- Trace Qty"進行電泳條帶的定量分析，計算血清中白蛋白含量。
[0050] 脂含量檢測：
[0051] 首先將血清樣品用生理鹽水稀釋3倍，得到牛血清樣品待測液；
[0052]然后以橄欖油為標準品，用乙醇配制成濃度為0.5mg/ml的脂含量測定標準溶液， 再用乙醇配制濃度分別為〇mg/ml、0 · lmg/ml、0 · 2mg/ml、0 · 3mg/ml、0 · 4mg/ml、0 · 5mg/ml的溶 液，繪制標準曲線；
[0053] 接著吸取牛血清樣品待測液和標準溶液各500μ1于玻璃試管中，各加入2ml硫酸并 煮沸l(wèi)Omin，室溫放置30min使其完全冷卻后，再于每試管中加入4ml磷酸一香草醛試劑反應 40min；
[0054] 最后在530nm測定吸收值并乘以稀釋倍數(shù)，代入標準曲線中計算牛血清樣品中的 脂含量。
[0055] 檢測結果如表1所示，各樣品的電泳膠片如圖1所示。
[0056]表1各樣品檢測結果
[0057]
[0058]注:表中的白蛋白含量為電泳條帶定量掃描結果。
[0059] 理論上講，與新生牛血清質量相比，胎牛血清質量更好，而小牛血清質量較差。表1 中數(shù)據(jù)證明，該測定結果準確，與理論相符。
[0060] 表1中，雜蛋白條帶深淺度一欄中的數(shù)字表示雜蛋白條帶的深淺度，按照由淺至深 的順序依次為1、2、3、4。雜蛋白條帶的深淺度可用于表示雜蛋白含量的高低，雜蛋白條帶越 深說明該樣品中雜蛋白含量越高。雜蛋白條帶深淺度的等級劃分方法為:將胎牛血清的雜 蛋白條帶的深淺度定義為1級，將小牛血清的雜蛋白條帶的深淺度定義為4級，深淺度在1級 與4級之間且更接近1級的定義為2級，深淺度在1級與4級之間且更接近4級的定義為3級。 [0061 ] 實施例2
[0062] 牛血清樣品：選取國內7個不同廠家的16批牛血清以及選自國外1個廠家的2批牛 血清，共計8個廠家18批血清，并從1~18依次進行編號。
[0063] 所用試劑和儀器同實施例1。
[0064]按照如下方法對各樣品進行檢測：
[0065]總蛋白含量檢測：同實施例1。
[0066] 白蛋白及雜蛋白含量檢測：
[0067] 凝膠的配制:分離膠凝膠濃度為15%，濃縮膠凝膠濃度為4.5%。
[0068]加樣:使用BIO-RAD MINI 2電泳槽和10孔樣品梳;待濃縮膠聚合后拔去樣品梳，加 入牛血清樣品，每孔加樣20yL。
[0069] 電泳及染色:接通電源，開始電泳;待電泳結束后，使用考馬斯亮藍法過夜染色后， 取出脫色，直至凝膠底色幾乎無色。
[0070] 掃描及分析:使用BI0-RAD光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer對電 泳膠片進行掃描后，使用分析軟件"Quantity One"中的條帶分析方法"Band Attributes- Trace Qty"進行電泳條帶的定量分析，計算血清中白蛋白含量;并按照實施例1中所說方法 評定各樣品雜蛋白條帶的深淺度。
[0071] 脂含量檢測：同實施例1。
[0072]檢測結果如表2所示，各樣品的電泳膠片分別如圖2和圖3所示。
[0073] 表2 1#~18#樣品檢測結果
[0076] 注:表中的白蛋白含量為電泳條帶定量掃描結果。
[0077] 將上述18個牛血清樣品用于CH0細胞培養(yǎng)，并對細胞收液進行純化，觀察細胞生長 狀態(tài)及純化效果。
[0078] 結果發(fā)現(xiàn):在使用3#、5#樣品進行細胞培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)細胞生長較慢、狀態(tài)不好，不能 滿足傳代時間間隔和傳代比例，該兩批樣品可能為經(jīng)過稀釋后的牛血清。使用7#、8#、9#牛 血清樣品的細胞收液進行純化時，發(fā)現(xiàn)抗原原液的HPLC譜圖有較多雜蛋白峰，說明此四批 牛血清的采血牛齡長，雜質含量高。使用17#、18#樣品的細胞收液進行純化時，發(fā)現(xiàn)純化收 率和純化介質壽命均受到嚴重影響，且抗原原液的HPLC譜圖除了有較多小分子蛋白峰以 外，抗原峰嚴重拖尾。而1#、2#、4#、6#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#樣品的細胞培養(yǎng)及純 化效果均較優(yōu)，說明前述樣品為質量合格的新生牛血清，這與本發(fā)明方法鑒定的結果完全 吻合。
【主權項】
1. 一種鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 在按照《中國藥典》三部附錄的方法對牛血清樣品進行各指標全檢的基礎上，進行總蛋 白含量、白蛋白含量以及脂含量的檢測；總蛋白含量為4.0-4.5g/100ml;白蛋白含量定量掃 描結果為1.0~1.5 ;脂含量為5.5-6.5mg/ml的待鑒定樣品為質量合格的新生牛血清。2. 根據(jù)權利要求1所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，按照《中國藥典》三 部附錄，"電泳法"中的"SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法"對待鑒定樣品進行非還原電泳檢測， 將電泳結果進行定量掃描分析，計算待鑒定樣品中的白蛋白含量。3. 根據(jù)權利要求1所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，采用香草醛顯色法 測定待鑒定樣品的脂含量。4. 根據(jù)權利要求2所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，所述白蛋白含量檢 測包括以下步驟： 凝膠的配制:分離膠凝膠濃度為15%，濃縮膠凝膠濃度為4.5%; 加樣:使用BIO-RAD MINI 2電泳槽和10孔樣品梳;待濃縮膠聚合后拔去樣品梳，加入待 鑒定樣品，每孔加樣20yL; 電泳及染色:接通電源，開始電泳;待電泳結束后，使用考馬斯亮藍法過夜染色后，取出 脫色，直至凝膠底色幾乎無色，得電泳膠片； 掃描及分析:使用BIO-RAD光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer對所得電 泳膠片進行掃描后，使用分析軟件"Quantity One"中的條帶分析方法"Band Attributes 一 Trace Qty"進行電泳條帶的定量分析，計算血清中的白蛋白含量。5. 根據(jù)權利要求1所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，還包括評定雜蛋白 含量的步驟。6. 根據(jù)權利要求5所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，按以下步驟評定雜 蛋白含量： 按照《中國藥典》三部附錄，"電泳法"中的"SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法"對胎牛血清和 小牛血清分別進行非還原電泳檢測，將胎牛血清電泳膠片上的雜蛋白條帶的深淺度定義為 1級，小牛血清電泳膠片上的雜蛋白條帶的深淺度定義為4級，將待測牛血清樣品電泳膠片 上的雜蛋白條帶的深淺度在1，2,3,4級之間進行評定，雜蛋白條帶深淺度為1級或2級的為 質量合格的新生牛血清。7. 根據(jù)權利要求3所述的鑒定新生牛血清質量的方法，其特征在于，所述脂含量檢測包 括以下步驟： 首先，將待鑒定樣品用生理鹽水稀釋3倍，得到樣品待測液； 然后，以橄欖油為標準品，用乙醇配制成濃度為0.5 mg/ml的脂含量測定標準溶液，再 用乙醇配制濃度分別為0mg/ml、0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml 的溶液，繪制標準曲線； 接著，吸取樣品待測液和標準溶液各500μ1于玻璃試管中，各加入2ml硫酸并煮沸 lOmin，室溫放置30min使其完全冷卻后，再向每試管中加入4ml磷酸一香草醛試劑反應 40min； 最后，在530nm測定吸收值并乘以稀釋倍數(shù)，代入標準曲線中計算待鑒定樣品的脂含 量。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鑒定新生牛血清質量的方法，包括以下步驟：按照《中國藥典》三部附錄的方法對待鑒定樣品全檢均合格；按《中國藥典》三部附錄，“蛋白質測定法”中的“Lowry法”檢測待鑒定樣品中的總蛋白含量；按照《中國藥典》三部附錄，“電泳法”中的“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”對待鑒定樣品進行非還原電泳檢測，將電泳結果進行定量掃描分析，計算待鑒定樣品中的白蛋白含量；采用香草醛顯色法測定待鑒定樣品的脂含量；所測總蛋白含量為4.0-4.5g/100ml；白蛋白含量定量掃描結果為1.0~1.5；脂含量為5.5-6.5mg/ml的待鑒定樣品為質量合格的新生牛血清。本發(fā)明可快速有效的篩選出質量好的新生牛血清，解決了現(xiàn)有篩選方法費時費力的問題。
【IPC分類】G01N27/447, G01N21/33
【公開號】CN105572208
【申請?zhí)枴緾N201510957853
【發(fā)明人】張衛(wèi)婷, 王煒, 荀英, 李潛, 張亞麗, 洪慶福, 譚麗霞, 李巖異, 張紅霞, 劉海俠, 戴碧璇, 臧文偉, 高珊
【申請人】華北制藥金坦生物技術股份有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月18日