YPSDIAVE 肥SNGQPENNYKTTPPVLDS DGSF化YSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVM肥 ALHNHYTQK化化SPGK，
[0151] RAM41c的氨基酸序列沈Q ID N0:14
[0152] DIQMTQSPGT L化SPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRIXIYGTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ P抓FAVYYCQ QYGRSLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC.
[0153] 本發(fā)明的抗(ox)MIF抗體優(yōu)選為游離型單克隆抗體。該抗MIF抗體可W是IgG、IgM、 I巧、IgA或I曲分子。在其它實(shí)施例中，該抗MIF抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞單位。在其 它實(shí)施例中，該抗體為IgGl或IgG4亞單位。在另一些實(shí)施例中，該抗體為IgG4亞單位。在某 些實(shí)施例中，IgG4抗體具有單位點(diǎn)突變，由絲氨酸(第228位絲氨酸，根據(jù)Rabat編號(hào)規(guī)則）突 變?yōu)楦彼?。因此，IgG4的Fc區(qū)域的亞序列由CPSC變?yōu)镃PPC，其為IgGl的一個(gè)亞序列(Angal 等，Mol Immunol ,30,105-108( 1993))。
[0154] 另外，抗(ox)MIF抗體的制備可包括本領(lǐng)域中用于抗體純化的任何已知方法，例 如，通過(guò)陰離子交換色譜法或親和色譜法。在一個(gè)實(shí)施例中，抗(ox)MI巧亢體可W通過(guò)尺寸 排阻色譜法從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化。
[0K5]術(shù)語(yǔ)MIF的"中屯、區(qū)域"和乂端區(qū)域"是指分別含35-68號(hào)氨基酸和86-115號(hào)氨基酸 的人類(lèi)MIF區(qū)域，分別優(yōu)選分別含人類(lèi)MIF的50-68號(hào)氨基酸和86至102號(hào)氨基酸。
[0156] 本發(fā)明特別優(yōu)選的抗體可與人類(lèi)MIF的50-68號(hào)氨基酸區(qū)域或86-102號(hào)氨基酸區(qū) 域結(jié)合。運(yùn)也可W通過(guò)與優(yōu)選抗體RAB0、RAB4、RAB2和RAB9，W及RAM4、RAM9和RAM0的結(jié)合反 映出來(lái)，其結(jié)合如下：
[0157] RAB4 和 RAM4:86-102 號(hào)氨基酸 [015引 RAB9和RAM9:50-68號(hào)氨基酸
[0159] RAB0 和 RAM0:86-102 號(hào)氨基酸
[0160] RAB2:86-102 號(hào)氨基酸
[0161] 術(shù)語(yǔ)"表位"包括任何能夠特異性地與免疫球蛋白或抗體片段結(jié)合的蛋白質(zhì)決定 簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)性質(zhì)活躍的表面基團(tuán)分子組成，例如裸露的氨基酸、氨基 糖或其它糖側(cè)鏈并且通常具有特定的Ξ維結(jié)構(gòu)特性W及特定的電荷特性。
[0162] 術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠運(yùn)輸與其連接的另一種核酸分子的一種核酸分子。在某些實(shí) 施例中，所述載體為質(zhì)粒，即連接有附加 DNA的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。
[0163] 術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"是指細(xì)胞株，其能夠在導(dǎo)入表達(dá)載體之后產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ) "重組細(xì)胞株"是指其已導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞株。應(yīng)該理解"重組細(xì)胞株"不僅是特定的 被操作的細(xì)胞株也代表該細(xì)胞株的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響，特定突變可能會(huì)發(fā)生 在后代中，因此運(yùn)樣的后代事實(shí)上與母細(xì)胞可能并不相同，但仍包含在此處使用的術(shù)語(yǔ)"重 組細(xì)胞株"的范圍內(nèi)。
[0164] 根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞為如COS細(xì)胞、C冊(cè)細(xì)胞或如皿K293細(xì)胞，或任何一種本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的任何其他宿主細(xì)胞，因此例如包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí) 施例中，抗MIF抗體在添加了 G418作為篩選標(biāo)記的DHFR缺陷的畑0細(xì)胞株中表達(dá)，例如 DXB11。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被導(dǎo)入C冊(cè)宿主細(xì)胞后，通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段時(shí) 間足W使得抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中從而制備抗體。 抗(ox)MI巧亢體可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法從培養(yǎng)基中回收。
[0165] 非常驚奇地，本申請(qǐng)發(fā)明人表明在結(jié)合前避免本領(lǐng)域的-甲醒固定步驟的可行性 和特別重要性。如果運(yùn)種固定使用(無(wú)機(jī)或有機(jī))試劑進(jìn)行，即使是熟知的且經(jīng)常使用固定 劑甲醒或丙酬，（在組織切片中使用最普遍的固定劑），樣品中的MI問(wèn)尋傾向于發(fā)生構(gòu)象的改 變而產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。運(yùn)種可能，即使只是一種理論，運(yùn)種固定劑/溶劑會(huì)促使MIF蛋白質(zhì) 內(nèi)部結(jié)構(gòu)重排而導(dǎo)致產(chǎn)生與oxMIF表位相似的結(jié)構(gòu)。
[0166] 發(fā)明人意外地證明如果在結(jié)合抗oxMIF抗體步驟前不使用固定步驟則能夠獲得良 好且可靠的結(jié)果。運(yùn)與本領(lǐng)域技術(shù)人員的期望相反，他們一般認(rèn)為為了得到適當(dāng)結(jié)果，固定 步驟是必須的，其被那些本領(lǐng)域常用方法經(jīng)實(shí)踐而廣泛地確認(rèn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中， 組織樣品切片的厚度為2至15μπι。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，該切片的厚度為5至ΙΟμπι。
[0167] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)水平準(zhǔn)備活組織，新鮮冷凍或OCT包埋W及 具有上述厚度的切片。若無(wú)另外說(shuō)明，下列方法和染色程序等步驟在優(yōu)選的室溫下進(jìn)行。
[0168] 在優(yōu)選實(shí)施例中，在實(shí)際操作步驟開(kāi)始前切片在空氣中干燥20至45分鐘，優(yōu)選為 30分鐘左右。
[0169] 在本IHC檢測(cè)的方法的優(yōu)選實(shí)施例中，樣品，特別是組織樣品，不被固定，特別是不 用任何無(wú)機(jī)或有機(jī)的固定劑或溶劑固定，如甲醒或丙酬。在可選的實(shí)施例中在第一次結(jié)合 之前可能進(jìn)行樣品干燥。尤其重要的是，所述干燥步驟W避免樣品氧化的方式進(jìn)行，特別是 其中可能包含(ox)MI即寸。空氣干燥被發(fā)明人證明可W實(shí)現(xiàn)運(yùn)種需求。該干燥步驟不需要干 燥組分，如具有氧化特性的醇類(lèi)組分。
[0170] 特別地，發(fā)明人證明通過(guò)在第一次結(jié)合步驟之前去掉固定步驟(運(yùn)意味著在可選 的封閉步驟之前也沒(méi)有固定步驟），能夠避免MIF的氧化;使用其它的步驟，MIF的結(jié)構(gòu)可能 會(huì)重排因此會(huì)在后續(xù)抗體與oxMIF結(jié)合中產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。然而，樣品在第一次結(jié)合步驟 之前可W進(jìn)行干燥。
[0171] 對(duì)于與本發(fā)明的結(jié)合化合物的特異性結(jié)合，優(yōu)選使用上述抗οχΜΙ巧亢體。在本發(fā)明 的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，運(yùn)些抗體是被生物素化的或者被本領(lǐng)域已知的巧光染料所標(biāo)記的。 在優(yōu)選實(shí)施例中，可使用封閉緩沖液進(jìn)行特異性結(jié)合，所述封閉緩沖液可W阻斷非特異性 結(jié)合。在該實(shí)施例的有效替代實(shí)施例中，封閉緩沖液含有山羊血清、血清白蛋白和魚(yú)類(lèi)明膠 的Ξ乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS )，在更優(yōu)選實(shí)施例中含有20 %普通山羊血清、2 %的血清白 蛋白和0.2 %的魚(yú)類(lèi)明膠的TBS。在一個(gè)可替換實(shí)施例中封閉液含有20 %普通山羊血清、2 % 的牛血清白蛋白和明膠的杜氏憐酸鹽緩沖液化PBS)。封閉緩沖液處理樣品優(yōu)選進(jìn)行15至45 分鐘，非常優(yōu)選30分鐘。已經(jīng)證明如果封閉緩沖液處理的時(shí)間低于15分鐘，信/噪比會(huì)劣化， 即相對(duì)于特異性信號(hào)背景信號(hào)會(huì)過(guò)高。
[0172] 此外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中抗oxMIF抗體的濃度范圍在0.3至20μg/ml之間。特別有 利地，抗oxMIF抗體的濃度范圍在0.5至16μg/ml之間。更加優(yōu)選地，抗oxMIF抗體的濃度范圍 在5至10μg/ml稀釋緩沖液。優(yōu)選地，切片可被oxMIF抗體溶液完全覆蓋，多數(shù)情況下50化1溶 液對(duì)于該目標(biāo)是充足的。
[0173] 抗oxMIF抗體優(yōu)選在第一稀釋緩沖液(一抗稀釋液）中被稀釋。在優(yōu)選的實(shí)施例中， 該第一稀釋緩沖液包含溶于TBS的牛血清白蛋白和魚(yú)類(lèi)明膠，在更優(yōu)選的實(shí)施例中包含溶 于TBS的2 %牛血清白蛋白和0.2 %的魚(yú)類(lèi)明膠。與抗oxMIF抗體的溫育時(shí)間優(yōu)選進(jìn)行45至90 分鐘，更優(yōu)選50-70分鐘，非常優(yōu)選60分鐘左右。
[0174] 在結(jié)合步驟之后，切片應(yīng)短暫地浸入新鮮的TBS(或如DPBS;清洗液）中洗去多余的 抗體;在替代的實(shí)施例中，在封閉液和稀釋液使用DPBS代替TBS時(shí)，浸潤(rùn)應(yīng)該用新鮮的DPBS。 在浸潤(rùn)后，在新鮮的清洗液中清洗的時(shí)間應(yīng)為約5至15分鐘，在更優(yōu)選的實(shí)施例中為10分 鐘。
[0175] 作為可選的步驟-其僅在第一次結(jié)合步驟之后執(zhí)行-其可W將樣品固定在合適的 固定溶劑中，例如甲醒憐酸鹽緩沖液中執(zhí)行10至25分鐘，優(yōu)選15至20分鐘。使用甲醒的該固 定步驟是可選的，其作用為保持組織結(jié)構(gòu)。該步驟對(duì)(ox)MIF結(jié)構(gòu)沒(méi)有消極作用也不會(huì)導(dǎo)致 假陽(yáng)性的結(jié)果。
[0176] 在該可選步驟之后，優(yōu)選地再次將切片短暫地浸入TBS(或DPBS)洗掉多余的甲醒； 浸潤(rùn)時(shí)間參照上文所述;之后在新鮮的TBS(或DPBS，分別地)溫育5-15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0177] 可選的，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶被阻斷。其可通過(guò)將組織切片放入如溶于甲醇中的出化 來(lái)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選為放入溶于甲醇的0.3%此化中20-30分鐘完成。多余的甲醇優(yōu)選地置于TBS中 清洗5-10分鐘去除。
[0178] 在運(yùn)些步驟之后，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，在合適的染色劑中進(jìn)行染色。在優(yōu)選 的實(shí)施例中使用皿P共輛的鏈霉親和素(其中HRP代表辣根過(guò)氧化物酶)進(jìn)行染色。或者，本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他檢測(cè)方法也是合適的；例如，巧光染料標(biāo)記的抗體可用作檢測(cè)工 具或者用巧光染料標(biāo)記鏈霉親和素。巧光染料標(biāo)記物的檢測(cè)已被發(fā)明人在本發(fā)明文本中證 明是合適的（參見(jiàn)，如實(shí)施例5)。在實(shí)施例5中已經(jīng)詳細(xì)說(shuō)明，步驟1和2在實(shí)施例5中是適用 的。
[01巧]優(yōu)選的染色劑為VECTASTAIN Elite ABC試劑。該染色時(shí)間應(yīng)持續(xù)至少20分鐘，優(yōu) 選至少30分鐘，在非常優(yōu)選的實(shí)施例中至少為45分鐘。
[0180] 優(yōu)選地，切片再次短暫地浸入TBS(或DPBS，參見(jiàn)上文)洗掉多余的二級(jí)試劑;之后 在優(yōu)選實(shí)施例中在新鮮的TBS或DPBS中進(jìn)行溫育5至15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0181] 在優(yōu)選實(shí)施例中得到的載片與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的底物作用顯色，例如適于 使用HRP顯色的底物，例如底物ImmPACT DAB，作用5至15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0182] 之后，在優(yōu)選實(shí)施例中切片短暫地浸入TBS (或DPBS，參見(jiàn)上文)洗去多余的底物然 后在新鮮的TBS或DPBS中溫育5至15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0183] 上述步驟之后，執(zhí)行細(xì)胞核染色的復(fù)染色步驟，所有用于免疫組織化學(xué)程序的熟 知的染色劑此處均可使用。在優(yōu)選實(shí)施例中使用蘇木精。染色應(yīng)進(jìn)行0.5至3分鐘，優(yōu)選為1 至2分鐘。
[0184] 切片之后用自來(lái)水沖洗并短暫地浸潤(rùn)(優(yōu)選再次浸入自來(lái)水）W洗掉多余的染色 劑。然后，在可選實(shí)施例中溫育2至6分鐘，優(yōu)選2至5分鐘。該溫育時(shí)間在使用蘇木精的情況 下根據(jù)顏色從藍(lán)紫色向藍(lán)色變化的出現(xiàn)而改變。
[0185] 用于顯微鏡的組織切片優(yōu)選為干燥的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，分別置于如 70%，然后90%，純乙醇中各2分鐘然后置于如二甲苯中凈化至少3分鐘。在另一個(gè)實(shí)施例中 干燥步驟為置于96%至純乙醇中2X 20秒。對(duì)長(zhǎng)期保存的切片使用VECTASTAIN化rmamount 進(jìn)行封片并使用蓋玻片覆蓋。干燥與封片步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員常識(shí)的一部分。
[0186] 本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)行解釋?zhuān)景l(fā)明的范圍均不限于此其由權(quán)利要求 書(shū)限定。
【具體實(shí)施方式】
[0187] 實(shí)施例1:通過(guò)免疫組織化學(xué)（1肥)對(duì)慢性腎炎患者的腎臟中oxMIF的原位檢測(cè)
[0188] 購(gòu)買(mǎi)到來(lái)自67歲慢性腎炎患者(補(bǔ)充診斷為腎小球硬化癥）尸體腎臟的低溫切片。 使用生物素化的RAM9抗體完成oxMIF的檢測(cè)。
[0189] 材料與方法
[0190] 根據(jù)專(zhuān)家們已知的本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行制備腎臟組織載片，新鮮冷凍或0CT包埋， 切割為10皿然后在切割后保存在^-80°c溫度下。下列所有步驟均在室溫下進(jìn)行。低溫切片 在空氣中干燥30分鐘且用封閉緩沖液（溶于TBS的20%普通山羊血清/2%牛血清白蛋白/ 0.2%魚(yú)類(lèi)明膠)阻斷非特異性結(jié)合30分鐘。然后切片與第一，優(yōu)選生物素化的，抗oxMIF抗 體(生物素化的RAM9)在濃度為化g/ml的第一抗體稀釋緩沖液（溶于TBS的2%牛血清白蛋 白/0.2%魚(yú)類(lèi)明膠）中溫育60分鐘。在TBS中清洗之后，樣品在4%甲醒PBS緩沖液中固定15-20分鐘。多余的甲醒通過(guò)在TBS中清洗10分鐘去除。使用VECTASTAIN Elite ABC試劑化RP標(biāo) 記鏈霉親和素)染色30分鐘。然后再次使用TBS大面積的清洗切片10分鐘。通過(guò)使用ImmPACT DAB底物10分鐘染色可目測(cè)為褐色，如圖1A中深灰色所示。在TBS中清洗載片且使用蘇木精 對(duì)細(xì)胞核復(fù)染色1-2分鐘。用自來(lái)水清洗載片使復(fù)染色由藍(lán)紫色變?yōu)樗{(lán)色。用于顯微鏡的組 織切片分別在70%、然后90%和純乙醇中各干燥2分鐘然后在二甲苯中凈化至少3分鐘。對(duì) 長(zhǎng)期保存的切片使用VECTASTAIN化rmamount進(jìn)行封片并使用蓋玻片覆蓋。
[0191] 結(jié)果
[0192] 檢測(cè)來(lái)自慢性腎炎患者腎臟中的oxMIF，主要染色在腎小管部分（圖1A中的深灰 色），而它的同型對(duì)照（Synagfe愈抗體，人類(lèi)IgGl)中觀察不到染色（圖1B)。在腎小球中僅觀 察到很少量的RAM9染色的細(xì)胞。切片中觀察到的藍(lán)色結(jié)構(gòu)（附圖1A和B中的圓點(diǎn)）為細(xì)胞核 (蘇木精染色）。值得注意的是，當(dāng)使用相同的方式進(jìn)行染色時(shí)來(lái)自正常腎臟的低溫切片中 檢測(cè)不到oxMIF。
[0193] 結(jié)論
[0194] 在患病器官例如來(lái)自慢性腎炎患者的腎臟中，通過(guò)IHC技術(shù)可在原位上檢測(cè)到 oxMIF，然而其并不存在于正常器官中。
[01M]實(shí)施例2:通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC)對(duì)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的膜腺中oxMIF的原位檢 測(cè)
[0196]購(gòu)買(mǎi)