專利名稱：用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色方法，具體地說涉及用于對繁殖型松材線蟲病進(jìn)行監(jiān)測和識別的化學(xué)染色方法。
背景技術(shù)：
松材線蟲病，俗稱松樹的“癌癥”，松樹一旦感染此病，長則半年，短則二個月就會死亡。此病自1982年在我國南京中山陵附近被首次發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)蔓延到包括江蘇、安徽、廣東、廣西、浙江、福建、上海、重慶、湖北、山東等10余省市，86縣市，受害面積達(dá)到126萬畝，對南方5億畝松林構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。而且發(fā)生范圍還在逐年擴(kuò)大。每年致死松樹600多萬株，造成直接經(jīng)濟(jì)損失25億元，間接損失達(dá)250億元(國家林業(yè)局統(tǒng)計(jì)資料)。目前，主要依靠清除所有病樹來進(jìn)行治理，從致病機(jī)理出發(fā)尋找適宜的防治方法成為當(dāng)務(wù)之急。松材線蟲病的病原——松材線蟲為我國最重要的外來入侵種之一，其侵染循環(huán)可分為繁殖型和擴(kuò)散型兩部分。繁殖型線蟲在健康松樹內(nèi)大量增殖而使松樹發(fā)病。隨著環(huán)境惡化，擴(kuò)散型三齡幼蟲(LIII)開始形成，從而進(jìn)入擴(kuò)散循環(huán)。LIII向松墨天牛的幼蟲蛀道和蛹室周圍聚集，隨著天牛的羽化而脫皮變?yōu)樗凝g持久型幼蟲(LIV)。LIV隨著天牛取食而被攜帶到新的健康松樹，開始新一輪的侵染循環(huán)。LIV通過取食或產(chǎn)卵時(shí)在樹皮上所造成的傷口進(jìn)入樹脂道，然后脫皮變成成蟲，這些雌、雄成蟲交尾后產(chǎn)卵，卵孵化后變?yōu)榉敝承陀紫x并大量繁殖而使松樹很快枯萎變黃再次成為松墨天牛產(chǎn)卵的對象，產(chǎn)卵孵化的松墨天牛幼蟲又進(jìn)入松材線蟲病樹內(nèi)取食蛀道。兩者協(xié)調(diào)配合，為對方完成生活史提供所需條件，并利用對方創(chuàng)造的條件完成自身發(fā)育。繁殖型線蟲的大量繁殖是松材線蟲和松墨天牛聯(lián)合造成松樹快速死亡的前提，如果能盡早檢測到繁殖型線蟲的存在，則在癥狀尚未發(fā)生的潛伏期就能發(fā)現(xiàn)病害并采取措施，預(yù)防在林區(qū)的擴(kuò)展。
目前在松材線蟲的口岸檢疫和林間發(fā)生地進(jìn)行調(diào)查及培養(yǎng)觀察時(shí)，繁殖型和擴(kuò)散型線蟲的識別都是使用顯微鏡蟲體特征觀察法。需要調(diào)查人員具有線蟲蟲體結(jié)構(gòu)的基本知識，而且繁殖型和擴(kuò)散型線蟲不易區(qū)分，特別是統(tǒng)計(jì)繁殖型和擴(kuò)散型線蟲的比率時(shí)更顯困難。另外，松材線蟲初步判定目前尚無可靠指標(biāo)，一些可靠的生化鑒定法操作復(fù)雜而且需要相關(guān)的設(shè)備和條件，在基層和野外不易進(jìn)行。
本發(fā)明源自于利用松樹寄主的萜烯類物質(zhì)可特異性地刺激繁殖型線蟲從化感器分泌特異性蛋白質(zhì)，并可用庫馬西亮藍(lán)進(jìn)行染色，從而可方便簡單地區(qū)分繁殖型線蟲和擴(kuò)散型線蟲。此方法可利用在口岸檢疫新鮮松樹的松材線蟲的鑒定上，也可用在野外調(diào)查及松材線蟲培養(yǎng)觀察時(shí)，繁殖型線蟲的調(diào)查統(tǒng)計(jì)上。由于操作簡單，易于判斷，此方法也可用作松材線蟲初步判定一項(xiàng)指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，解決在口岸檢疫的取樣和松材線蟲疫情發(fā)生地的調(diào)查取樣及松材線蟲培中的區(qū)分判斷繁殖型線蟲的非指標(biāo)性和復(fù)雜性，及發(fā)生地的調(diào)查時(shí)初步判定松材線蟲線蟲的可靠性。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，通過選定特定的化學(xué)成分及其配比配制一種刺激劑，該刺激劑可以刺激繁殖型線蟲從化感器分泌特異性蛋白質(zhì)，并將所分泌的特異性蛋白質(zhì)用庫馬西亮藍(lán)進(jìn)行染色，從而鑒別繁殖型線蟲。
本發(fā)明提供的用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，其步驟如下1、將含有組份A、B及組份C的刺激劑溶于有機(jī)溶劑中；所述刺激劑與有機(jī)溶劑的重量份配比為2-50∶100；所述刺激劑中的組份A、B及組份C的重量份配比為54-90∶9-43∶1-5；所述組份A為α-蒎烯，組份B為β-蒎烯，組份C為長葉烯；2、將溶于有機(jī)溶劑中的刺激劑滴入含有松材線蟲的水溶液中，并加入10μL的庫馬西亮藍(lán)(brillant-blue P-250)，在室溫下至少放置24小時(shí)，在顯微鏡下進(jìn)行觀察其分泌的特異性蛋白質(zhì)被染色的為繁殖型松材線蟲。
所述組份A、組份B及組份C的配比為90∶9∶1，效果最佳。
本發(fā)明用于鑒別繁殖型的化學(xué)染色法的操作方法為將按上述重量份配比的組份A、組份B和組份C組成的1.5μg刺激劑溶解在20μL二甲基亞砜(DMSO)后，加入至100μL含有松材線蟲的水溶液中，并加入10μL的0.2％brillant-blue P-250(庫馬西亮藍(lán))在室溫下放置24小時(shí)就可在顯微鏡下看到線蟲頭部分泌的被染色的特異性蛋白質(zhì)。組份A、組份B和組份C的重量份配比為90∶9∶1時(shí)，效果最佳。
目前尚無鑒別繁殖型的化學(xué)染色法，本發(fā)明用于鑒別繁殖型的化學(xué)染色法的優(yōu)異之處在于1)本發(fā)明提供的刺激繁殖型線蟲從化感器分泌特異性蛋白質(zhì)的刺激劑源自松樹揮發(fā)物，屬于天然有機(jī)物質(zhì)；其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，常溫常壓下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無毒，不污染環(huán)境；2)本發(fā)明提供的刺激劑含可刺激繁殖型線蟲從化感器分泌特異性蛋白質(zhì)的化合物萜類化合物，在市場上很容易購買，配制簡單；3)本發(fā)明操作簡便可靠，適用于基層的調(diào)查工作。
4)本發(fā)明在口岸及林間調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室中，達(dá)到了很好的鑒別繁殖型和松材線蟲初步判定的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-3按表1所列的重量份配比組成的刺激1.5μg溶于20μL的二甲基亞砜(DMSO)，然后加入100μL含有松材線蟲的水溶液中并加入10μL的0.2％ brillant-blue P-250(庫馬西亮藍(lán))在室溫下放置24小時(shí)(每一處理作10重復(fù))；并將觀察到的染色效果列于表1。
表1 不同重量份配比組成的刺激對繁殖型松材線蟲的染色效果

由表可知，使用本發(fā)明提供的用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，具有很好的鑒定效果，為我國松材線蟲的檢疫和調(diào)查研究提供了一種新的方法。
實(shí)施例4-6按表2所列的重量份配比組成的刺激0.5μg溶于20μL的三乙二醇二醋酸酯，然后加入100μL含有松材線蟲的水溶液中并加入10μL的0.2％ brillant-blue P-250(庫馬西亮藍(lán))在室溫下放置24小時(shí)(每一處理作10重復(fù))；并將觀察到的染色效果列于表1。
表2 不同重量份配比組成的刺激對繁殖型松材線蟲的染色效果

實(shí)施例7-9按表3所列的重量份配比組成的刺激10.5μg溶于20μL的二氯甲烷，然后加入100μL含有松材線蟲的水溶液中并加入10μL的0.2％brillant-blue P-250(庫馬西亮藍(lán))在室溫下放置24小時(shí)(每一處理作10重復(fù))；并將觀察到的染色效果列于表3。
表3 不同重量份配比組成的刺激對繁殖型松材線蟲的染色效果

權(quán)利要求
1.一種用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，其步驟如下1)將含有組份A、B及組份C的刺激劑溶于有機(jī)溶劑中；所述刺激劑與有機(jī)溶劑的重量份配比為2-50∶100；所述刺激劑中的組份A、B及組份C的重量份配比為54-90∶9-43∶1-5；所述組份A為α-蒎烯，組份B為β-蒎烯，組份C為長葉烯；2)將溶于有機(jī)溶劑中的刺激劑滴入含有松材線蟲的水溶液中，并加入10μL的庫馬西亮藍(lán)，在室溫下至少放置24小時(shí)，在顯微鏡下進(jìn)行觀察其分泌的特異性蛋白質(zhì)被染色的為繁殖型松材線蟲。
2.按權(quán)利要求1所述的用于鑒別擴(kuò)散型松材線蟲的化學(xué)染色方法，所述組份A、組份B及組份C的配比為90∶9∶1。
全文摘要
本發(fā)明的用于鑒別繁殖型松材線蟲的化學(xué)染色法，步驟是1)將刺激劑溶于二甲基亞砜溶劑中；刺激劑與二甲基亞砜的重量份配比為2－50∶100；刺激劑中的組份A、B及組份C重量份配比為54－90∶9－43∶1－5；組份A為α－蒎烯，組份B為β－蒎烯，組份C為長葉烯；2)將溶于二甲基亞砜中的刺激劑滴入含有松材線蟲的水溶液中，并加入10μL的重量百分濃度為0.2％的庫馬西亮藍(lán)，室溫下放置24小時(shí)，顯微鏡下觀察其分泌的特異性蛋白質(zhì)被染色的為繁殖型松材線蟲。本發(fā)明使用的刺激劑源自松樹揮發(fā)物，屬天然有機(jī)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無毒，無污染；且操作簡便可靠，適于口岸及林間基層繁殖型松材線蟲調(diào)查及檢疫。
文檔編號G01N31/22GK101042335SQ20061005844
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月24日
發(fā)明者孫江華, 韋衛(wèi), 趙莉藺, 劉杏忠 申請人:中國科學(xué)院動物研究所