抗-mif的免疫組織化學(xué)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及巨隧細(xì)胞移動抑制因子(MIF)的特異性檢測，特別是組織中的氧化型 巨隧細(xì)胞移動抑制因子(oxMIF)。本發(fā)明提供一種使用免疫組織化學(xué)的檢測方法，其特征在 于使用了特異性的抗-oxMI巧亢體。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨隧細(xì)胞移動抑制因子(MIF)最初是基于其能夠抑制對結(jié)核菌素非常敏感的豚鼠 (含巨隧細(xì)胞）的腹膜滲出細(xì)胞在體外隨機(jī)移動的能力而被分離的細(xì)胞因子（Bloom等， Science .，153，80-2( 1966)，David等，PNAS .，56，72-7( 1966))。今天，MIF被認(rèn)為是天生的和 獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵的上游調(diào)節(jié)因子，其可施加一系列多效性的活動。
[0003] 人類MIF的cDNA已于 1989年被克?。╓eiser等，PNAS. ,86,7522-6(1989))，其基因 組被定位于22號染色體上。人類MIF基因的產(chǎn)物是一個含114個氨基酸（切除N端甲硫氨酸 后）、約12.5kDa表觀分子量的蛋白質(zhì)。MIF與其他任何蛋白沒有顯著的序列同源性。該蛋白 質(zhì)結(jié)晶成相同亞基的Ξ聚體。每個單體包含兩個反向平行的α螺旋，α螺旋堆集成有四條鏈 的0折疊。該單體有另外兩個0鏈，它們與相鄰亞基的0折疊相互作用形成單體之間的交界 面。Ξ個亞基排列形成桶，該桶含有溶劑可到達(dá)的通道，該通道沿著分子的Ξ折疊軸穿過蛋 白質(zhì)的中屯、（Sun等，PNAS. ,93,5191-5196(1996))。
[0004] 據(jù)報道低濃度的糖皮質(zhì)激素可m秀導(dǎo)巨隧細(xì)胞分泌MIF(Calan化a等，Nature.， 377,68-71 (1995))。然而，MIF也可W反向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的效果并且刺激其他細(xì)胞因子如 腫瘤壞死因子TNF-a和白介素 IL-Ιβ等的分泌（Baugh等，Crit Care Med，30，S27-35 (2002))"MIF也被證明有如促血管生成，促增生和抗細(xì)胞調(diào)亡的特性，因此可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 生長（Mitchell，R.A，Cellular Si 即ailing. ,16(1) :p. 13-19(2004) ;Lue，H.等， 化cogene.，26 (35): p. 5046-59 (2007))。其也與如淋己瘤，黑素瘤和結(jié)腸瘤的生長直接相關(guān) (Nishihira等，J Interferon Cytokine Res.,20:751-62(2000))。
[0005] MIF是許多疾病狀態(tài)的中介因子，因此其與多種疾病相關(guān)聯(lián)，包括但不限于炎癥性 腸?。↖抓），類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，哮喘，腎小球腎炎，IgA型腎 病，屯、肌梗死(MI )，脈毒病和癌癥。對抗重組人類MIF的多克隆和單克隆抗MI巧亢體已被研發(fā) (Shimizu等，F(xiàn)EBS Lett.,381,199-202(1996);Kawaguchi等，Leukoc.Biol.,39,223-232 (1986);Weiser等，Cell.Immunol.,90,167-78(1958)).
[0006] 有人建議抗MIF抗體用于治療。Calan化a等(J. Inflamm.，47，39-51 (1995))曾報道 使用抗MIF抗體可W保護(hù)動物免于實驗誘導(dǎo)的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性的脈毒性休克?？?MIF抗體也被建議用作一種治療手段用W調(diào)節(jié)脈毒性休克和其他炎性疾病狀態(tài)下細(xì)胞因子 的產(chǎn)生。
[0007] US 6645493中公開了來源于雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗MIF抗體，其抵消了MIF的生物 活性。在動物模型中顯示出運(yùn)些鼠源的抗MIF抗體在處理內(nèi)毒素引發(fā)的休克的治療上取得 了有益的效果。
[000引 US 200310235584中公開了在動物體內(nèi)制備MIF高親和力抗體的方法，該方法中 MIF基因被純合性地敲除。
[0009] Galat等人描述了糖基化抑制因子（GIF)蛋白化ur. J.Biochem.，224,417-21 (1994)) eMIF和GIF現(xiàn)在被認(rèn)為是相似的。Wa化rai等（PNAS.，97，13251-6( 1997))描述了與 不同的GIF表位相結(jié)合的多克隆抗體W便確定Ts細(xì)胞中GIF經(jīng)翻譯后修飾的生物化學(xué)本質(zhì)。 Wa化rai等先前曾報道在體外GIF出現(xiàn)的不同構(gòu)象同工型。一種異構(gòu)體是由對單個半脫氨酸 殘基進(jìn)行化學(xué)修飾而產(chǎn)生的。該化學(xué)修飾導(dǎo)致了 GIF蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變。
[0010] MIF的水平，即在各種疾病攻擊之后，尤其是在炎癥性疾病和癌癥攻擊之后檢測到 MIF通常水平會提高。然而，MIF也在健康的個體內(nèi)循環(huán)，其產(chǎn)生了一個明顯的區(qū)別困難。相 反地，oxMIF不存在于健康對象體內(nèi)。oxMIF在疾病狀態(tài)下會增加并且可從病患的采樣，如血 液，血清和尿樣中被檢測到。
[0011] 在對MIF和其抗體的徹底研究之后發(fā)現(xiàn)，抗體RAB9、RAB4和RAB0特異性地與oxMIF 結(jié)合(不能與redMIF結(jié)合）。
[0012] 在發(fā)明人早期進(jìn)行的實驗中，證明氧化性的操作步驟如脫氨酸介導(dǎo)氧化，GSSG(氧 化型谷脫甘膚)介導(dǎo)氧化或和Proclin300進(jìn)行的MIF培養(yǎng)，或蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(例如BM0E)均會 引發(fā)MIF與上述抗體的結(jié)合。
[0013] 該發(fā)明人推出的令人驚奇的結(jié)論是：
[0014] ?重組的MIF(人源、曬齒類源、鼠源、C冊細(xì)胞源、猴源）的氧化還原調(diào)節(jié)(脫氨酸/ GSSG介導(dǎo)輕度氧化)或利用Proclin300或蛋白交聯(lián)劑對重組MIF的處理均會導(dǎo)致其與己克 斯特系抗MIF抗體RAB9，RAB4和RAB0相結(jié)合；
[0015] 參oxMIF的減少導(dǎo)致Ab結(jié)合的降低；
[0016] ?oxMIF異構(gòu)體的特異性與體內(nèi)生物學(xué)Ab的功效相關(guān)；
[0017] ?oxMIF的水平與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
[0018] 關(guān)于MIF的其他知識作為本發(fā)明人進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。
[0019] 目前，對組織切片中的oxMIF進(jìn)行檢測和染色方法尚不存在。已經(jīng)知道MIF存在不 同的異構(gòu)體。天然存在的oxMIF的被認(rèn)為是一項對與MIF相關(guān)的疾病狀態(tài)的有力和可靠的指 標(biāo)，通過免疫組織化學(xué)下稱為IHC)或免疫巧光（IF)方法對其在組織，例如載玻片上的組 織切片的特異性檢測受到下述事實的阻礙：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)IHC或IF方法時，oxMIF的結(jié)構(gòu)易受 影響或頻繁地完全丟失。
[0020] 因此，明確地需要一種oxMIF異構(gòu)體的可靠的檢測方法。本申請發(fā)明人解決了該需 要，而且下文描述的發(fā)明實現(xiàn)了該目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明設(shè)及一種用于oxMIF(氧化型巨隧細(xì)胞移動抑制因子)檢測的檢測方法。該 檢測方法基于一種免疫組織化學(xué)的原理。其在組織樣品，尤其是組織切片中使用。
[0022] 優(yōu)選地，運(yùn)些組織切片提供在玻璃或塑料載體上，例如玻璃的或塑料的載物片。
[0023] 該方法使用對oxMIF具有特異性的結(jié)合抗體。
[0024] 本發(fā)明中使用的優(yōu)選的抗體為單克隆抗體。在特別優(yōu)選的實施例中，單克隆抗 oxMIF抗體選自由RAB9、RAB0和/或RAB4構(gòu)成的組，或者選自由RAM9、RAM0和/或RAM4構(gòu)成的 組，其在下文中將進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)勢特異性已通過(參照下文的實施例部分)可利用同型對照抗體(不能 夠檢測oxMIF因此適合作為陰性對照)或多克隆抗MIF抗體(與全部MIF相結(jié)合，由refMIF和 oxMIF構(gòu)成，適合作為陽性對照）的對照染色表明了本發(fā)明有利的特異性，并且其已通過本 申請發(fā)明人的其他發(fā)現(xiàn)(即oxMIF只能在疾病，例如癌癥組織中被檢測到)而證實。
[0026] 該檢測方法的優(yōu)選實施例中包含染色步驟。該創(chuàng)造性的檢測/染色步驟本身被設(shè) 計為用于保存組織切片中的天然oxMIF的結(jié)構(gòu)。目前所知的針對本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)手段會 導(dǎo)致MIF向oxMIF的轉(zhuǎn)變，因此會在免疫組織化學(xué)技術(shù)中產(chǎn)生假陽性染色。
[0027] 本發(fā)明具體內(nèi)容
[0028] 通過下列諸項描述本發(fā)明或其一部分：
[0029] 1.-種用于體外檢測oxMIF的免疫組織化學(xué)（IHC)測定方法，其特征在于，所述 oxMIF為個體組織樣品中可與抗體RAB4、RAB9和/或RAB0差異性結(jié)合的MIF，其包含用于體外 確定化合物與所述樣品中oxMIF結(jié)合的步驟。
[0030] 2.項1所述的IHC測定，其特征在于，與oxMIF結(jié)合的所述化合物是與oxMIF特異性 結(jié)合的抗體。
[0031 ] 3.項2所述的I肥測定，其特征在于，所述抗體與oxMIF結(jié)合，而不與redMIF結(jié)合。
[0032] 4.項3所述的IHC測定，其特征在于，所述差別性結(jié)合是指與oxMIF結(jié)合的其Kd值為 lOOnM W下，優(yōu)選50nM W下，更優(yōu)選lOnMW下，而不與redMIF結(jié)合的特征在于其Kd值為400nM 社。
[003；3] 5 .項2至4所述的IHC測定，其特征在于所述抗體選自由oxMIF連接物，例如抗體 RAB4、RAB9和/或RAB0和/或RAM4、RAM巧口/或RAM0構(gòu)成的組。
[0034] 6.上述任一項所述的IHC測定，其特征在于，所述樣品為組織活體，優(yōu)選冷凍組織 活體，優(yōu)選0CT包埋切片，或忍針活組織穿刺。
[0035] 7.上述任一項所述的I肥測定，其特征在于，執(zhí)行下列步驟中的一步或多步：
[0036] a)利用封閉緩沖液進(jìn)行的可選封閉步驟和
[0037] b)不進(jìn)行前述步驟，使用第一抗-oxMIF抗體的結(jié)合步驟；
[003引 C)可選的固定步驟；
[0039] d)與第二抗體溫育;和/或
[0040] e)染色
[0041 ] 8.前述任一項所述的IHC測定，其特征在于，在結(jié)合步驟之前沒有使用有機(jī)或無機(jī) 固定液，特別是甲醒或丙酬進(jìn)行固定。
[0042] 9.項7或8所述的IHC測定，其特征在于，在可選的固定步驟之后和/或在第一結(jié)合 步驟之前，樣品進(jìn)行空氣干燥，優(yōu)選約30分鐘。
[0043] 10.項7-9任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述第一抗體是生物素化的 和/或優(yōu)選地包含在第一稀釋緩沖液和/或其中所述第一抗體與樣品溫育優(yōu)選進(jìn)行45-90分 鐘，更優(yōu)選進(jìn)行大約60分鐘。
[0044] 11.項7-10任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，在溫育步驟d)之后進(jìn)行清 洗步驟W洗去多余的抗體。
[0045] 12.項7-11任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述第二抗體是結(jié)合了辣 根過氧化物酶化RP)的鏈霉親和素。
[0046] 13.項7-12任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，在溫育步驟d)之后進(jìn)行清 洗步驟。
[0047] 14.項7-13任一項或多項所述的IHC測定，其特征在于，所述染色步驟使用蘇木精 進(jìn)行。
[0048] 15.上述任一項所述的IHC測定，其特征在于，所述結(jié)合步驟使用生物素化的或者 巧光染料標(biāo)記的結(jié)合指示劑進(jìn)行。
[0049] 16.-種I肥測定盒，適用于執(zhí)行上述一項或多項所述的方法。
[0050] 上述抗體的不僅可由其自身的基因序列而且通過儲存于大腸桿菌化.coli，TGl菌 株)的質(zhì)粒中進(jìn)行表征和支持，上述抗體包含上述抗體RAB0、RAB4和/或RAB9 W及RAM0、RAM4 和RAM9中每一個各自的輕鏈或重鏈。
[0051] 運(yùn)些質(zhì)粒的特征在于它們的DSM編號，其為根據(jù)布達(dá)佩斯條約在德國微生物菌種 保藏中屯、（DSMZKMascheroder Weg化，Braunschweig,Germany)進(jìn)行保藏而獲得的官方編 號。運(yùn)些質(zhì)粒分別保藏在大腸桿菌中。
[0化2] 編號為DSM25110質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB4的輕鏈序列。
[0化3] 編號為DSM25112質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB4的重鏈(IgG4)序列。
[0化4] 在適合的宿主細(xì)胞中質(zhì)粒DSM25110和DSM25112的共表達(dá)產(chǎn)生優(yōu)選的抗MIF抗體 RAB4。
[0055] 編號為DSM25111的質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB9的輕鏈序列。
[0化6] 編號為DSM25113的質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB9的重鏈(IgG4)序列。
[0化7] 在適合的宿主細(xì)胞中質(zhì)粒DSM25111和DSM25113的共表達(dá)產(chǎn)生優(yōu)選的抗MIF抗體 RAB9。
[0化引編號為DSM25114的質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB0的輕鏈序列。
[0化9 ] 編號為DSM25115的質(zhì)粒含抗MIF抗體RAB0的重鏈(I gG4)序列。
[0060] 在適合的宿主細(xì)胞中質(zhì)粒DSM25114和DSM25115的共表達(dá)產(chǎn)生優(yōu)選的抗MIF抗體 RABOo
[0061 ] 同樣被保藏的有抗體RAM0、RAM9和RAM4;均已根據(jù)布達(dá)佩斯條約在DSMZ保藏(2012 年4月12日于德國布倫瑞克），編號如下：
[0062] RAM9-重鏈：E.coli GA.662-0l.pRAM9hc-DSM 25860。
[0063] RAM4-輕鏈:E.coli GA.906-04.pRAM41c-DSM 25861。
[0064] RAM9-輕鏈：E.coli GA.661-01.pRAM91c-DSM 25859。
[00化]RAM4-重鏈：E.coli GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
[0066] RAMO-輕鏈：E.coli GA.906-0l.pRAMOlc-DSM 25863。
[0067]