從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體(exosome)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]外泌體(Exosome)是一種穿梭在細胞間具有雙分子層的納米級囊泡。外泌體可由多種細胞分泌到細胞外，不同細胞分泌的外泌體可以具有類似的或不同的特性和生物學(xué)功能。腫瘤細胞也能釋放外泌體，且腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到細胞外影響腫瘤微環(huán)境，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色已經(jīng)越來越受關(guān)注。外泌體不僅在體液如血清、血楽、尿液中能穩(wěn)定存在，還能選擇性的包裹/釋放其細胞中的遺傳信息(miRNA、蛋白等)，因此提取細胞外的外泌體用于疾病、腫瘤等的診斷、監(jiān)控有巨大的應(yīng)用潛能。
[0003]目前，外泌體提取的研究主要集中在細胞、血清樣本中提取外泌體，其主要采取的提取方法有:超高速離心法、過濾離心法、密度梯度超高速離心法、免疫磁珠結(jié)合超高速離心法、色譜法。這些方法各有缺點，例如，超高速離心法以及免疫磁珠結(jié)合超高速離心法均需要采取lOOOOOg及以上的超高速離心，對設(shè)備要求高，提取成本昂貴；再例如，超高速離心法和過濾離心法均存在純度不高的問題；密度梯度離心法雖然純度高但其步驟繁雜、耗時、量少；色譜法需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不廣泛。此外，無論是從細胞還是血清樣本中提取外泌體，在樣本收集中都不可避免地會對患者進行創(chuàng)傷性操作，以獲取血液或細胞，并且，為了滿足后續(xù)檢測的實驗要求，有時候需要收集大量的樣本，因此，類似的有創(chuàng)提取方式在臨床應(yīng)用上存在很大的局限性。所以，尤其需要發(fā)展一種能夠可靠、快速、經(jīng)濟地?zé)o創(chuàng)分離提取外泌體尤其是腫瘤來源的外泌體的方法。
[0004]外泌體在尿液中能穩(wěn)定存在，而且，尿液樣品容易大量獲得并能避免創(chuàng)傷性損傷，因此，如果能夠檢測尿液外泌體中的腫瘤信息，則有望將其用于腫瘤的無創(chuàng)診斷、監(jiān)控等應(yīng)用。但是，實際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無法滿足后續(xù)檢測測序的要求，因此，鮮少有文獻報道尿液中外泌體的提取方法。在現(xiàn)有的為數(shù)極少的提取尿液中外泌體的相關(guān)文獻中，均明顯存在不少問題而導(dǎo)致無法臨床應(yīng)用。例如:題為“Isolat1n and Purificat1n of Exosomes in Urine”的文章(Gonzales PA等，Methods Mol B1l.2010 ;641:89-99)中公開了兩種從尿液中分離外泌體的方法，采用超速離心或超濾管的方法提取了外泌體，其中，超速離心的方法，污染雜質(zhì)較多，操作也非常繁瑣，還需要配置超高速離心機，臨床應(yīng)用推廣困難；而借助超濾管的方法，雖然能避免超高速離心機的使用，但是避免不了其他蛋白聚集或大分子蛋白復(fù)合體等的殘留，對后續(xù)針對exosome的實驗研究也會帶來錯誤信息。此外，尿液中的外泌體來源非常復(fù)雜，無法評估其中屬于腫瘤細胞分泌的外泌體?；谝陨系南拗疲壳吧形从形墨I公開報道從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體(exosome)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法，能夠從腫瘤患者的尿液中獲得高量、特異性高且能直接用于后續(xù)的流式技術(shù)檢測的腫瘤細胞來源的外泌體。
[0006]—種從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法，依次包括以下步驟:
[0007](1)將尿液樣本收集于第一離心管中，2?8°C、300?500g離心10?15分鐘，分離得到上層液體；
[0008](2)將所述上層液體進行冷凍干燥，得到沉淀；
[0009](3)用緩沖液將所述沉淀進行重懸，得到第一重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8 ;將所述第一重懸液在2?8°C、10000?12000g離心30?40分鐘，分離得到上清液；
[0010](4)將所述上清液與總外泌體抽提液以2:1的體積比在第二離心管混合，震蕩均勻后，2?8°C孵育6?16小時，然后，將孵育后的混合液在2?8°C、10000?12000g離心60?80分鐘，移除上層清液后，在所述第二離心管的底部得到固相物質(zhì)，為尿液總外泌體；
[0011](5)用緩沖液將所述尿液總外泌體進行重懸，得到第二重懸液，為尿液總外泌體的重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8 ;
[0012](6)將所述第二重懸液加入到吸附有上皮細胞粘附分子(Epithelial celladhes1n molecule, EpCAM)抗體標(biāo)記磁珠的第三離心管中，2?8°C孵育6?16小時；
[0013](7)將所述第三離心管置于磁力架，吸附2?10分鐘，移除管內(nèi)液體，這樣在所述第三離心管中得到磁珠結(jié)合的腫瘤細胞來源的外泌體。
[0014]本發(fā)明中，步驟(3)和步驟(5)中，所述的緩沖液可以相同，也可以不同。優(yōu)選步驟(3)和步驟(5)中均為磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，最優(yōu)選為IX磷酸鹽緩沖液。
[0015]本發(fā)明中，在步驟(7)之后，還可以向所述第三離心管中加入緩沖液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8，然后將所述第三離心管置于磁力架吸附2?10分鐘，再移除管內(nèi)液體，從而對所述的磁珠結(jié)合的腫瘤細胞來源的外泌體進行清洗。優(yōu)選重復(fù)該清洗步驟2?3次。優(yōu)選所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選為IX磷酸鹽緩沖液。
[0016]采用上述的本發(fā)明方法，只需要患者一次取樣的常規(guī)量(10?100ml)的尿液樣本，即可提取到能夠用于后續(xù)檢測測序的足夠量的腫瘤細胞來源的外泌體。本發(fā)明中，優(yōu)選尿液樣本的體積為25?50ml。
[0017]采用本發(fā)明的上述方法，尿液樣本經(jīng)一次離心分離后進行凍干處理得到沉淀，使用緩沖液對所得沉淀進行重懸時，優(yōu)選所述緩沖液的體積為0.5?2.5ml，以不超過1ml為最佳。在最佳的條件下，第一重懸液經(jīng)離心分離得到的上清液的體積不超過1ml，而所用總外泌體抽提液的體積不超過0.5ml，這樣，所用總外泌體抽提液的成本不超過40元。
[0018]因此，本發(fā)明還提供了以下優(yōu)選的技術(shù)方案:
[0019]—種從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法，依次包括以下步驟:
[0020](1)將25?50ml尿液樣本收集于第一離心管中，4°C、300?500g離心10?15分鐘，分離得到上層液體；
[0021 ] (2)將所述上層液體進行冷凍干燥，得到沉淀；
[0022](3)用0.5?2.5ml緩沖液將所述沉淀進行重懸，得到第一重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8 ;將所述第一重懸液在4°C、10000?12000g離心30?40分鐘，分離得到上清液；
[0023](4)將所述上清液與總外泌體抽提液以2:1的體積比在第二離心管混合，震蕩均勻后，4°C孵育6?16小時，然后，將孵育后的混合液在4。。、10000?12000g離心60?80分鐘，移除上層清液后，在所述第二離心管的底部得到固相物質(zhì)，為尿液總外泌體；
[0024](5)用0.5?2.5ml緩沖液將所述尿液總外泌體進行重懸，得到第二重懸液，為尿液總外泌體的重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8 ;
[0025](6)將所述第二重懸液加入到吸附有上皮細胞粘附分子抗體標(biāo)記磁珠的第三離心管中，4°C孵育6?16小時；
[0026](7)將所述第三離心管置于磁力架，吸附2?10分鐘，移除管內(nèi)液體，這樣在所述第三離心管中得到磁珠結(jié)合的腫瘤細胞來源的外泌體。
[0027]同樣，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)和步驟(5)中，所述的緩沖液可以相同，也可以不同。進一步優(yōu)選步驟(3)和步驟(5)中均為磷酸鹽緩沖液(Phosphate BufferedSaline，PBS)，最優(yōu)選為1 X磷酸鹽緩沖液。
[0028]同樣，在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，在步驟(7)之后，還可以向所述第三離心管中加入
0.5?2.5ml緩沖液，其中，所述緩沖液的pH值為7?8，然后將所述第三離心管置于磁力架吸附2?10分鐘，再移除管內(nèi)液體，從而對所述的磁珠結(jié)合的腫瘤細胞來源的外泌體進行清洗。該清洗步驟可以重復(fù)2?3次。優(yōu)選所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選為IX磷酸鹽緩沖液。
[0029]在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟⑴中，所述離心時間為10分鐘。
[0030]在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)中，所述離心時間為30分鐘。
[0031]在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟⑷中，所述離心時間為60分鐘。
[0032]在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(7)中，所述吸附時間為5分鐘。
[0033]本發(fā)明中，所述的總外泌體抽提液可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常用的市售總外泌體抽提液，例如:Exosome Isolat1n kit (Life Technologies)、Exoquick (System B1science)、Exo-spin (Cell Guidance System)等；優(yōu)選 Invitrogen 公司生產(chǎn)的 Total ExosomeIsolat1n，可由市場購得。
[0034]本發(fā)明中，所述的上皮細胞粘附分子抗體標(biāo)記磁珠可以通過商業(yè)途徑購買得到，例如:Exosome-Human EpCAM Isolat1n Reagent (Invitrogen)、CD326 (EpCAM)MicroBeads (Miltenyi B1tec)、EasySep? Human EpCAM Positive Select1nKit (StemCell);優(yōu)選 Invitrogen 公司生產(chǎn)的 EpCAM beads。
[0035]本發(fā)明中，所述的尿液樣本為腫瘤患者的尿液樣本。