一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢 測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清鐵蛋白（serum ferritsn，SF)簡稱鐵蛋白，是廣泛存在于生物機(jī)體內(nèi)的一種 貯存鐵的可溶組織蛋白，由一個蛋白質(zhì)外殼和一個鐵核心構(gòu)成。SF的鐵核心具有強(qiáng)大的結(jié) 合鐵和貯存鐵的能力，以維持機(jī)體鐵的供應(yīng)和血紅蛋白的相對穩(wěn)定。
[0003] 研究表明，血清鐵蛋白的含量與機(jī)體儲存鐵是成一定比例的，lug/L的血清鐵蛋白 對應(yīng)于8-10mg或每公斤體重120ug儲存鐵。血清鐵蛋白作為一個生物標(biāo)志物在醫(yī)學(xué)檢驗 中最常應(yīng)用于評價體內(nèi)儲存鐵的狀況及診斷缺鐵性貧血。不同的檢測方法確定的正常參考 值都有所差別，通常成年男性血清鐵蛋白的正常參考值都在30-300ng/mL左右，成年女性 血清鐵蛋白的正常參考值在10-160ng/mL左右，血清鐵蛋白水平在妊娠期及急性貧血時降 低。臨床上血清鐵蛋白的檢測能甄別出缺鐵的早期階段，從而能盡早地采取調(diào)整膳食結(jié)構(gòu) 或補(bǔ)充鐵劑等措施，預(yù)防缺鐵性貧血的發(fā)生。
[0004] 肝臟是合成和儲存鐵蛋白的主要場所，當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥，其代謝就發(fā)生障礙，鐵蛋 白隨之發(fā)生變化。一般肝炎急性期、慢性肝炎活動期、肝硬化活動期，血清鐵蛋白顯著增高。 而且肝細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，其含量越高。國內(nèi)報道肝癌患者陽性率高達(dá)90%。肝癌患者治療 有效者血清鐵蛋白下降，而惡化和再發(fā)者升尚，持續(xù)增尚則予后不良，故血清鐵蛋白測定可 作為療效監(jiān)測手段之一。血清鐵蛋白還是一個非特異性的腫瘤標(biāo)志物，如患肝癌、肺癌、胰 癌、白血病等時，癌細(xì)胞合成的鐵蛋白增加，均能使血清鐵蛋白升尚。
[0005] 目前，定量檢測SF的方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、時間分辨焚 光免疫分析法、膠體金法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法。每種檢測方法都有各自的優(yōu)勢，但在檢測 準(zhǔn)確度、耗時、安全性、檢測價格及操作等方面又存在一定局限性，限制了以上檢測方法的 廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是為了提供一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)、線性范圍寬的血 清鐵蛋白含量檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的上述目的可通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種血清鐵蛋白含量檢測試劑 盒，試劑盒包括試劑RU試劑R2和鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；
[0008] 試劑Rl的組分為：緩沖液：5-50mM，電解質(zhì)：100-200mM，封閉劑：0. 5-3wt %，表面 活性劑：〇· 05-0. 5wt %，防腐劑：0· 05-0. 5wt %，促凝劑：0· 5-5wt % ;
[0009] 試劑R2的組分為：緩沖液：5-50mM，電解質(zhì)：100-200mM，封閉劑：0. 5-3wt %，金屬 螯合劑：3-10mM，表面活性劑：0· 05-0. 5wt %，防腐劑：0· 05-0. 5wt %，保護(hù)劑：3-10wt %，鐵 蛋白單克隆抗體F(ab'）2片段致敏的納米膠乳微粒：0. 05-0. 5wt%。
[0010] 本發(fā)明中試劑Rl是以5-50mM的緩沖液為母液，向母液中加入電解質(zhì)、封閉劑、表 面活性劑、防腐劑和促凝劑配制而成。
[0011] 本發(fā)明中試劑R2是以5-50mM的緩沖液為母液，向母液中加入電解質(zhì)、封閉劑、金 屬螯合劑、表面活性劑、防腐劑、保護(hù)劑和鐵蛋白單克隆抗體F(ab'） 2片段致敏的納米膠乳 微粒配制而成。
[0012] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀 釋至 100-1000ng/mL 的。
[0013] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的組分為：緩沖 液：5-50mM，電解質(zhì)：100-200mM，BSA :0. 5-3wt %，金屬螯合劑：3-10mM，表面活性劑： 0. 05-0. 5wt %，防腐劑：0. 05-0. 5wt %，保護(hù)劑：3-10wt %。本發(fā)明中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是以 5-50mM的緩沖液為母液，向母液中加入電解質(zhì)、BSA、金屬螯合劑、表面活性劑、防腐劑和保 護(hù)劑配制而成。
[0014] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的pH為7-8。
[0015] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，試劑Rl和試劑R2的pH均為7-8。
[0016] 作為優(yōu)選，試劑Rl、試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的緩沖液均為醋酸-醋酸鈉緩沖液、 磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或2-嗎啉乙磺酸緩沖液中的一種。進(jìn)一步優(yōu)選為 磷酸鹽緩沖液。
[0017] 作為優(yōu)選，試劑RU試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的電解質(zhì)均為氯化鈉、氯化鈣中的 一種。進(jìn)一步優(yōu)選為氯化鈉。
[0018] 作為優(yōu)選，試劑RU試劑R2的封閉劑均為BSA、酪蛋白、明膠、馬血清、與偶聯(lián)抗體 不同來源的IgG中的一種。
[0019] 作為優(yōu)選，試劑RU試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的表明活性劑均為TritonX-100、吐 溫-20或布里杰-35中的一種。進(jìn)一步優(yōu)選為吐溫-20。
[0020] 作為優(yōu)選，試劑RU試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的防腐劑均為疊氮鈉或proclin系 列中的一種。
[0021] 作為優(yōu)選，試劑Rl中的促凝劑為PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、硫酸葡聚 糖鈉中的一種。進(jìn)一步優(yōu)選為PEG6000。
[0022] 作為優(yōu)選，試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的金屬螯合劑均為EDTA。
[0023] 作為優(yōu)選，試劑R2和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中的保護(hù)劑均為葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一 種。
[0024] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，鐵蛋白單克隆抗體F(ab'）2片段 致敏的納米膠乳微粒通過將兩株配對的鐵蛋白單克隆抗體分別經(jīng)過酶切、純化后獲得的 F(ab'）2片段與納米膠乳微粒偶聯(lián)后得到。
[0025] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，納米膠乳微粒的粒徑為50-300nm。 進(jìn)一步優(yōu)選為200nm。
[0026] 在上述的一種血清鐵蛋白含量檢測試劑盒中，納米膠乳微粒為表面帶有羧基功能 基團(tuán)的聚苯乙烯膠乳微粒。
[0027] 本發(fā)明采用化學(xué)交聯(lián)方法，將具有高特異性、高親和力的鐵蛋白抗體偶聯(lián)至聚苯 乙烯膠乳微粒表面的羧基官能團(tuán)上，當(dāng)此微球與含有待測樣本混合時，在合適的反應(yīng)條件 下，抗體與樣本中抗原特異結(jié)合，形成抗原-抗體-膠乳微粒復(fù)合物，在短時間內(nèi)迅速聚集 在一起，改變反應(yīng)液的散光或透光性能，并且在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液吸光度值變化與待測樣 本中的抗原含量成正比關(guān)系，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可根據(jù)樣本吸光度值變化測定 待測物含量。
[0028] 利用IgG抗體制備免疫比濁試劑的一個限制是易于受到測試樣品類風(fēng)濕因子引 起的干擾。類風(fēng)濕因子（RF)是抗人IgG分子Fc片段上抗原決定族的特異性抗體。大多動 物來源的IgG類抗體，F(xiàn)c段與人IgG的Fc段具有較高的同源性，能被RF識別并結(jié)合，所以 在待測物質(zhì)為陰性、RF陽性的檢測樣本中，免疫檢測試劑有可能被RF捕獲產(chǎn)生信號，從而 導(dǎo)致假陽性結(jié)果。胃蛋白酶能酶切作用于IgG抗體連接兩重鏈的二硫鍵靠 C端處，使IgG 抗體裂解成F(ab'）2片段和Fc片段。F(ab'）2片段由兩個Fab'片段通過二硫鍵連接，保留 了抗體的結(jié)合點。經(jīng)過protein G親和純化獲得的F (ab'）2片段與IgG相比，F(xiàn) (ab'）2的 特點是去掉了 Fc段包括其被類風(fēng)濕因子識別的位點，因此用F(ab'）2片段制備的膠乳增強(qiáng) 免疫比濁試劑就不會受到類風(fēng)濕因子的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確度與特異性。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法研制的血清鐵蛋白含量檢測試 劑盒具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)、線性范圍寬等特點，并能在多種全自動生化 分析儀、特種蛋白分析儀上使用，更利于SF檢測試劑盒在臨床上的推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明實施例1血清鐵蛋白含量檢測試劑盒的定標(biāo)曲線；
[0031] 圖2為本發(fā)明實施例1血清鐵蛋白含量檢測試劑盒的線性范圍曲線；
[0032] 圖3為本發(fā)明實施例1血清鐵蛋白含量檢測試劑盒和對比例1試劑盒的相關(guān)性曲 線。
【具體實施方式】
[0033] 以下是本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合【附圖說明】，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描 述，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
[0034] 應(yīng)用本發(fā)明試劑盒測定血清鐵蛋白含量的測試條件為：采用日立7060全自動生 化分析儀，設(shè)置檢測波長為570nm/700nm，樣本：試劑Rl :試劑R2 = 1:40:80,校準(zhǔn)類型為非 線性，校準(zhǔn)方法為五點定位。
[0035] 測試方法為：樣本（標(biāo)準(zhǔn)品或臨床樣本）與試劑Rl混勻，于37°C孵育3-5分鐘后， 加入試劑R2混勻，37°C孵育30秒后讀取吸光度值A(chǔ)l，再孵育5分鐘后讀取吸光度值A(chǔ)2,計 算ΔΑ = Α2-Α1。以鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，以各濃度標(biāo)準(zhǔn)品測得的ΔΑ為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以待測樣本AA在定標(biāo)曲線上求得相應(yīng)的鐵蛋白含量。
[0036] 實施例1 :
[0037] 本實施例血清鐵蛋白含量檢測試劑盒主要由試劑RU試劑R2和鐵蛋白校準(zhǔn)品組 成，
[0038] 其中，試劑 Rl 的組分為：PB 緩沖液：10mM、NaCl :150mM、BSA :lwt %、吐溫-20 : 0· Iwt %、疊氮鈉：0· Iwt %、PEG6000 : Iwt % ;pH 為 7. 4 ;
[0039] 試劑R2 的組分為：PB 緩沖液：10mM、NaCl :150mM、BSA :lwt%、EDTA :5mM、吐溫-20 : 0. lwt%、疊氮鈉：0.