用于檢測磺胺藥物的試劑盒和試紙條及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析領域中用于檢測磺胺藥物的試劑盒和試紙條及其應用。
【背景技術】
[0002] 磺胺藥物是一類具有對氨基苯磺酰胺結構的化學藥物，其中應用較廣并有確切療 效的有數(shù)十種，由于其價格便宜、使用方便，廣泛應用于動物疾病防治和促生長。磺胺藥物 的不合理使用在畜牧產(chǎn)品中產(chǎn)生了嚴重的殘留現(xiàn)象，食品中殘留的磺胺藥物會危害人們的 身體健康，長期攝入含有磺胺藥物殘留的食物可引起細菌耐藥性增加，產(chǎn)生腎臟毒性，影響 造血系統(tǒng)等毒副作用。
[0003] 隨著人們對食品安全的日益重視，歐盟、中國、美國、日本等國家相繼對動物源性 食品中磺胺藥物最大殘留限量值作出了規(guī)定，其中歐盟和中國規(guī)定磺胺藥物總量的最高殘 留限量為IOOppb。
[0004] 目前磺胺藥物的檢測方法主要有儀器法（包括高效氣相色譜、高效液相色譜以及 色質(zhì)聯(lián)用技術等）、微生物法、免疫分析方法以及受體分析方法等，這些方法各有特點：儀 器法準確、可靠、靈敏度高，是一種確證方法，但是不適合現(xiàn)場快速檢測；微生物法可同時檢 測多種抗生素，但靈敏度不高、檢測時間長，且無法定量；免疫分析方法基于抗原抗體的特 異結合，具有靈敏度高、特異性強、可定量檢測等優(yōu)勢，但由于靈敏度高且可識別同一類藥 物的抗體難以獲得，制約了其在獸藥殘留檢測領域中的應用。如能開發(fā)出可同時檢測多種 磺胺藥物的產(chǎn)品將有助于磺胺藥物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何檢測多種磺胺藥物。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了一種檢測磺胺藥物的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所提供的一種檢測磺胺藥物的試劑盒，包括包被原和酶標記物；所述包被 原為蛋白質(zhì)flop ;所述酶標記物是將標記酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸偶聯(lián)在一 起得到的偶聯(lián)物；所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0008] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0009] b)將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 上述試劑盒中，所述標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶；辣根過氧化物 酶可采用現(xiàn)有技術中的多種方法將其與4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸進行偶聯(lián)，如二 環(huán)己基碳二亞胺偶聯(lián)法等。
[0011] 上述試劑盒還包括如下中的至少一種：磺胺二甲基嘧啶標準溶液、底物顯色液、終 止液、洗滌液、樣品稀釋液、包被緩沖液和封閉液。
[0012] 上述試劑盒中，所述磺胺二甲基嘧啶標準溶液可以是一定濃度范圍內(nèi)的多種濃 度的標準溶液，例如可以在〇-l〇〇ng/mL之間，如磺胺二甲基嘧啶的濃度分別為50ng/mL、 25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL和 L 6ng/mL〇
[0013] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由E液和F液組成，所述E液可為 過氧化脲溶液或過氧化氫溶液（具體如質(zhì)量百分含量為2 %的過氧化脲溶液），所述F液可 為四甲基聯(lián)苯胺溶液或鄰苯二胺溶液（具體如質(zhì)量百分含量為1 %的四甲基聯(lián)苯胺溶液）。 所述終止液可為硫酸溶液，其濃度可為1-2M (如0. 2M)。
[0014] 上述試劑盒中，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液，在本發(fā)明的一個實施例中，所述洗滌 液具體為含有吐溫20和疊氮化鈉的濃度為0. 01M，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液；吐溫-20 在所述洗滌液中的體積含量為〇. 05%，疊氮化鈉在所述洗滌液中的濃度為5mg/mL。
[0015] 上述試劑盒中，所述包被緩沖液的pH為8. 0,由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水， 所述溶質(zhì)及其濃度為：20mMTris、30mM MgCl2。
[0016] 上述試劑盒中，所述封閉液為磷酸鹽緩沖液；在本發(fā)明的一個實施例中，所述封閉 液具體為pH 7. 4,含脫脂奶粉的濃度為0. 02M的磷酸鹽緩沖液；脫脂奶粉在所述封閉液中 的濃度為20mg/mL。
[0017] 所述包被緩沖液和所述封閉液也可以是本領域常用的其它包被緩沖液和封閉液。
[0018] 上述試劑盒中，所述樣品稀釋液具體為pH值為8.0,由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為 水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris、5mM MgCl2、2% (質(zhì)量百分含量）脫脂奶粉、l:1500(v/v) 的6-羥甲基-7, 8二氫蝶呤焦磷酸鹽（DHPPP)。
[0019] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述試劑盒的制備方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的所述試劑盒的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟：
[0021] (1)將所述包被原和所述酶標記物分別單獨包裝的步驟；
[0022] (2)將所述包被原、所述酶標記物、所述磺胺二甲基嘧啶標準溶液、所述底物顯色 液、所述終止液、所述洗滌液、所述樣品稀釋液、所述包被緩沖液和所述封閉液分別單獨包 裝的步驟。
[0023] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種檢測磺胺藥物的膠體金試紙。
[0024] 本發(fā)明所提供的一種檢測磺胺藥物的膠體金試紙，包括相互連接的樣品墊、膠體 金墊、反應膜和吸收墊；所述反應膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間；所述膠體金墊 包被有膠體金標記的帶有HIS標簽的所述的蛋白質(zhì)flop ;所述反應膜上含有檢測線和質(zhì)檢 線，所述檢測線包被有4- (4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸和載體蛋白，所述質(zhì)檢線包被有抗 所述HIS標簽的單克隆抗體；所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0025] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0026] b)將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0027] 上述膠體金試紙中，所述樣品墊的末端與所述膠體金墊的始端相連，所述膠體金 墊的末端與所述反應膜的始端相連，所述反應膜的末端與所述吸收墊的始端相連。
[0028] 上述膠體金試紙中，所述反應膜上的檢測線（T線）和質(zhì)檢線（C線）均是與所述 膠體金試紙的長相垂直的條帶狀；所述檢測線位于近于所述膠體金墊末端的一側；所述質(zhì) 檢線位于遠離所述膠體金墊末端的一側。
[0029] 上述膠體金試紙中，所述載體蛋白可為卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、血藍蛋白、鼠血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或兔血清白蛋白，具體可為卵清白蛋白。
[0030] 上述膠體金試紙中，所述抗所述HIS標簽的單克隆抗體具體可為鼠抗HIS標簽單 克隆抗體。
[0031] 上述膠體金試紙中，所述樣品墊可為纖維素濾膜；所述反應膜可為硝酸纖維素膜； 所述吸收墊可為吸水紙；所述膠體金墊可為包被有膠體金標記的蛋白質(zhì)flop的玻璃纖維 膜；樣品孔位于所述膠體金試紙頂端，所述樣品墊的始端為所述膠體金試紙頂端。
[0032] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述膠體金試紙的制備方法。
[0033] 本發(fā)明所提供的所述膠體金試紙的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟：
[0034] (1)分別制備所述的檢測磺胺藥物的膠體金試紙中所述樣品墊、所述膠體金墊和 所述反應膜；
[0035] (2)將步驟（1)得到的所述樣品墊、所述膠體金墊、所述反應膜和所述吸收墊相 互連接，得到所述反應膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間的檢測磺胺藥物的膠體金試 紙。
[0036] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中磺胺藥物的方法。
[0037] 本發(fā)明所提供的一種檢測樣品中磺胺藥物的方法，為如下I或II所示的方法：
[0038] I、檢測樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟：
[0039] 1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣品溶液；
[0040] 2)用所述試劑盒對所述待測樣品溶液進行檢測；
[0041] 所述待測樣品為牛奶：將牛奶用上述的樣品稀釋液按1:5的體積比進行稀釋， 4°C、1000 Orpm離心，取上清液，作為待測樣品溶液；
[0042] 所述待測樣品為奶粉：稱取Ig奶粉，溶于5mL上述的樣品稀釋液中，混合均勻，作 為待測樣品溶液。
[0043] 所述待測樣品為尿液：將尿液直接作為待測樣品溶液；
[0044] 所述待測樣品為雞肉、魚、蝦或蛋：將所述待測樣品勻漿處理，得到均質(zhì)樣品，將每 5g所述均質(zhì)樣品加入IOmL乙腈水溶液中，上下顛倒震蕩10min，5000rpm離心10min，取上 清，氮氣吹干，用ImL上述的樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣品溶液；乙腈水溶液 中乙腈和水的體積比為9:1 ;
[0045] 所述待測樣品為蜂蜜：將每5g所述待測樣品加入到15mL去離子水中，混合，得到 混合液；將所述混合溶液用Oasis固相萃取柱進行純化，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹 干，用ImL上述的樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣品溶液。
[0046] II、檢測樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟：
[0047] 1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣品溶液；
[0048] 2)用所述膠體金試紙對所述待測樣品溶液進行檢測；
[0049] 所述膠體金試紙檢測結果的判斷：
[0050] 陰性：C線顯色，T線肉眼可見，無論顏色深淺均判為陰性。
[0051] 陽性：C線顯色，T線不顯色，判為陽性。
[0052] 無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙卡均判為無效。
[0053] 上述檢測樣品中磺胺藥物的方法中，所述方法為非疾病診斷目的的方法和/或非 治療目的的方法。
[0054] 上述的試劑盒，或上述的膠體金試紙，或上述的方法中，所述磺胺藥物為下述中的 至少一種：磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、 磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧 啶