TCCGTGCTAGAAGGAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGT G-3'）和 2.0uL濃度為 0. 36uM的酶鏈DM(序列為；5'-CACGTCCATCTCTGCAGT CGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3'）混合于 46uL的MES雜交緩沖 液（50mlMES，300mlNaN〇3，pH=5. 5)中，升溫至 85 °C反應 2min后W1°C/min的速度 冷卻至室溫，得到雙鏈DNAzyme溶液；接著，加入10yL濃度為1mg/mL的磁珠分散液(表 面修飾Streptavidin;直徑；約1ym)，混合溶液在37 °C下恒溫振蕩30min使DNAzyme均 勻地固定在磁珠表面。用磁鐵分離固定有DNAzyme雙鏈的磁珠，并用100yLMES雜交緩 沖液清洗S次后，把固定有DNAzyme雙鏈的磁珠分散在50yL的MES雜交緩沖液中，0-4°C 存儲備用； (2) 連接探針功能化納米金（Lp-AuNPs)的制備：將5uL濃度為10ppm的AuNPs (表面修飾Streptavidin;直徑；15nm)和5uL濃度為10uM的連接探針DNA(Lp， 5' -biotin-AAAAATAGTGAGTT-3'）加入到 40uL的PBS緩沖液（10ml，pH=7. 4)中， 混勻后在37 °C下恒溫振蕩1h，制得連接探針修飾的AuNPs(Lp-AuNPs)溶液，0-4°C存儲 備用。
[0016] (3)HRP修飾信號探針（HRP-Sp)的制備：將2. 5yL濃度為10yM的信號探針 (Sp，5, -biotin-ATATATTGTCCGTGCTAGAAGGAACTCACTAT-3，）和 2.5uL濃度為 0.02mg/mL的HRP溶液加入到25uL的PBS緩沖液中，混勻后，在37°C下恒溫振蕩30 min,制得HRP-Sp溶液，0-4°C存儲備用； (4)實際水樣中痕量U〇2"的可視化檢測：在濃度為0.02至15ppb范圍內(nèi)，取3至4個 不同濃度U〇2"標準溶液各10yL，與50yL步驟（1)制備的DNAzyme功能化的磁珠分散 液混勻，室溫下，振蕩1h;在磁鐵作用下分離磁珠后，用100yL的PBS緩沖液洗漆3次， 再加入50UL步驟（2)制備的固定有連接探針的納米金懸浮液(AuNPs-Lp)，37 °C下恒溫 振蕩1h;在磁鐵作用下分離磁珠后，用100yL的PBS緩沖液洗漆3次，再加入30yL步 驟（3)制備的HRP-Sp，混勻后37 °C下恒溫振蕩30min;在磁場作用下分離磁珠后，用100 ULPBS緩沖液洗漆5次，加入300uLTMB/H2O2溶液，振搖20min后通過裸眼觀測顏色 變化或通過紫外分光光度計測定吸光度，用作比對標準。
[0017] 實施例2 取10UL經(jīng)0.22ym濾膜過濾的閩江水樣，按照實施例1的方法進行操作，最后觀測 顏色變化，對照實施例1所得的標準U〇2"離子溶液的顏色或吸光度，對水樣中的U0 2"離子 進行半定量或定量檢測，檢測結果如表1所示，與ICP-MS的測定結果基本相同，說明本發(fā)明 的方法是一種可視化快速檢測水環(huán)境中痕量軸酷離子的方法，適合于現(xiàn)場檢測。
[001引表1利用所建立的方法對閩江水樣中U〇2"離子的分析結果及與ICP-MS檢測結果 的對比
W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一種可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在于：將對UO 22+具有 特異性識別的DNAzyme固定在磁珠表面，在納米金表面預組裝辣根過氧化物酶；然后利用 UO 22+對DNAzyme的切割作用和DNA的雜交反應實現(xiàn)磁珠與納米金的連接，經(jīng)過外磁場的分 離收集后，辣根過氧化物酶高效催化H 2O2氧化四甲基聯(lián)苯胺使溶液由無色變?yōu)樗{色，從而 實現(xiàn)對UO2 2+離子的靈敏、特異可視化快速檢測。2. 根據(jù)權利要求1所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：包括以下步驟： (1) DNAzyme功能化磁珠儲備液的制備； (2) 固定有連接探針的納米金懸浮溶液的制備； (3) 辣根過氧化物酶修飾的信號探針溶液的制備； (4) 實際水樣中痕量UO22+的可視化檢測：取10 yL的實際水樣與步驟（1)制備的50 y L DNAzyme功能化磁珠儲備液混勻，室溫下振蕩I h;在磁鐵作用下分離磁珠后，用100 y L PBS緩沖液洗滌3次，隨后加入50 y L步驟（2)制備的固定有連接探針的納米金懸浮 溶液，混勻后，在37 °C下恒溫振蕩I h，得到連接有納米金的磁珠懸浮液；在磁鐵作用下分 離磁珠后，用100 UL的PBS緩沖液洗滌3次，加入30 yL步驟（3)制備的辣根過氧化物 酶修飾的信號探針溶液，混勻后，在37 °C下恒溫振蕩30 min;在磁鐵作用下，用100 y L的 PBS緩沖液清洗5次后，加入300 yL四甲基聯(lián)苯胺/H2O2溶液，振搖20 min后通過裸眼觀 測混合溶液顏色變化或應用紫外分光光度計測試溶液的吸光度對UO22+進行半定量及定量 快速檢測。3. 根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：步驟（1)具體為：在50 y L DNAzyme溶液中，加入10 y L I mg/mL磁珠分散液，混合均 勾；混合溶液在37 °C下恒溫振蕩30 min使DNAzyme均勾地固定在磁珠表面；用磁鐵分離 固定有DNAzyme的磁珠，并用100 y L MES雜交緩沖液清洗3次后，把固定有DNAzyme的磁 珠分散在50 y L MES雜交緩沖液中，0-4°C存儲備用。4. 根據(jù)權利要求3所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：所述的DNAzyme溶液的制備方法為：取2.0 yL 0.18 y M的底物鏈DNA，序列為： 5'-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT rA GGA AGA GAT GGA CGT G-3' 和 2.0 yL 0.36 y M 酶鏈 DNA，序列為：5'-CAC GTC CAT CTC TGC AGT CGG GTA GIT AAA CCG ACC !TC AGA CAT AGT GAG T-3'，混合于46 yL的MES雜交緩沖液中，升溫至85 °C 反應2 min后，以I °C /min的速度冷卻至室溫，得到雙鏈DNAzyme溶液。5. 根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：步驟（2)具體為：將5 yL 10 ppm金納米粒子和5 yL 10 yM連接探針DNA，其序列 為5'-biotin-AAA AAT AGT GAG IT-3'，加入到40 yL PBS緩沖液中，混勻后在37 °C下恒 溫振蕩I h，制得連接探針修飾的納米金懸浮溶液，0-4°C存儲備用。6. 根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：步驟（3)具體為：將 2.5 yL 10 yM 信號探針 5'-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT-3'和2. 5 y L 0. 02 mg/mL辣根過氧化物酶溶液加入到25 y L PBS 緩沖液中，混勻后，在37 °C下恒溫振蕩30 min，制得辣根過氧化物酶修飾信號探針溶液， 0-4 °C存儲備用。7. 根據(jù)權利要求3所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：所述的 MES 雜交緩沖液為：50 mM MES，300 mM NaNO3, pH=5. 5。8. 根據(jù)權利要求2所述的可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法，其特征在 于：步驟（4)所述的PBS緩沖液為：10 mM、pH=7. 4。
【專利摘要】本發(fā)明屬于水環(huán)境中痕量離子的檢測領域，具體涉及一種可視化快速檢測水環(huán)境中痕量鈾酰離子的方法。該方法主要為：將對UO22+具有特異性識別的DNAzyme固定在磁珠表面，在納米金表面預組裝辣根過氧化物酶；然后利用UO22+對DNAzyme的切割作用和DNA的雜交反應實現(xiàn)磁珠與納米金的連接，經(jīng)過外磁場的分離收集后，辣根過氧化物酶高效催化H2O2氧化四甲基聯(lián)苯胺使溶液由無色變?yōu)樗{色，從而實現(xiàn)對UO22+離子的靈敏、特異可視化快速檢測。該方法因具有靈敏度高、特異性強、抗基體干擾強、簡單快速和低成本等優(yōu)點，可用于各種水樣品中痕量UO22+離子的現(xiàn)場快速可視化檢測。
【IPC分類】G01N21/78, G01N21/33
【公開號】CN104964942
【申請?zhí)枴緾N201510373724
【發(fā)明人】付鳳富, 張紅艷, 阮雅娟
【申請人】福州大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月1日