一種基于核酸適配體修飾納米金的檢測手性化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于手性識(shí)別、比色分析和環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測 S-布洛芬和R-布洛芬的適配體比色檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性對映體的存在是自然界的一種普遍現(xiàn)象，作為生命活動(dòng)重要基礎(chǔ)的生物大分 子，如蛋白質(zhì)、多糖、核酸和酶等，幾乎全是手性的，這些小分子在體內(nèi)往往具有重要生理功 能。手性對映體在吸收、分布、代謝與排泄過程中，通過與體內(nèi)大分子的不同立體結(jié)合，產(chǎn)生 不同的藥理作用和反應(yīng)。在臨床治療方面，服用對映體純的手性藥物不僅可以排除由于無 效（不良）對映體所引起的毒副作用，還能減少藥劑量和人體對無效對映體的代謝負(fù)擔(dān)，對 藥物動(dòng)力學(xué)及劑量有更好的控制，提高藥物的專一性具有十分廣闊的市場前景和巨大的經(jīng) 濟(jì)價(jià)值。因此，手性對映體的分離、分析，對研宄生命科學(xué)、藥物化學(xué)以及人類健康都具有十 分重要的意義。目前世界上使用的藥物總數(shù)約為1900種手性藥物占50 %以上，在臨床常用 的200種藥物中，手性藥物多達(dá)114種。
[0003] 近年來，各種手性識(shí)別方法得到了發(fā)展。最簡單的是旋光度法，但是同一種光學(xué)活 性化合物的旋光方向會(huì)因測定的條件的改變而發(fā)生變化，與立體結(jié)構(gòu)之間缺少任何容易分 辨的聯(lián)系，通過測定旋光度來識(shí)別手性化合物就受到了局限。高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳 法等是將分離手段結(jié)合光度檢測來實(shí)現(xiàn)的，但是往往需要的手性色譜柱價(jià)格昂貴、較大的 試劑損耗且對分離的條件要求很高，分析時(shí)間長不利于快速識(shí)別。而光譜分析法和電化學(xué) 傳感器，靈敏度低和識(shí)別過程較為復(fù)雜。因此有待發(fā)展一種簡單、快速、靈敏的手性識(shí)別方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于核酸適體修飾納米金的手性化合物檢測方法，以 核酸適體修飾的納米金為手性選擇試劑，利用適體高選擇性和高親和性的特點(diǎn)，使用一段 可特異性識(shí)別S-布洛芬的單鏈核酸適配體探針（以及可特異性識(shí)別R-布洛芬的單鏈核 酸適配體探針）分別與金納米粒子結(jié)合形成金納米粒子-S-適配體復(fù)合探針和金納米粒 子-R-適配體復(fù)合探針，在有對應(yīng)的S-布洛芬存在的情況下，S-適配體復(fù)合探針與S-布 洛芬特異性結(jié)合，從而引起金納米粒子表面核酸適配體構(gòu)象變化，使得金納米粒子對鹽的 耐受能力降低從而出現(xiàn)金納米粒子聚沉出現(xiàn)藍(lán)色的現(xiàn)象；在有對應(yīng)的R-布洛芬存在的情 況下，S-適配體復(fù)合探針不會(huì)與R-布洛芬特異性結(jié)合，納米金不會(huì)在高鹽濃度下聚沉出現(xiàn) 藍(lán)色現(xiàn)象。同理，在有對應(yīng)的R-布洛芬存在的情況下，R-適配體復(fù)合探針與R-布洛芬特 異性結(jié)合，引起核酸適配體構(gòu)象變化，出現(xiàn)金納米粒子聚沉呈藍(lán)色的現(xiàn)象。相反在有S-布 洛芬存在下R-適配體復(fù)合探針復(fù)合的納米金粒子不會(huì)出現(xiàn)聚沉呈藍(lán)色的現(xiàn)象。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種基于核酸適配體修飾納米金的檢測手性化 合物的方法，其特征在于，具體步驟包括：
[0006] 第一步：制備金納米顆粒溶液；
[0007] 第二步：制備S-布洛芬適配體和R-布洛芬適配體中的至少一種；
[0008] 第三步：以S-布洛芬適配體為S-布洛芬的識(shí)別探針，將金納米顆粒溶液，S-布洛 芬適配體溶液、氯化鈉溶液和S-布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，定容，得到標(biāo)準(zhǔn)檢測液，反應(yīng)30min 后，根據(jù)金納米粒子聚沉引起其溶液變色程度的不同，通過紫外分光光度計(jì)檢則檢測體系 在650nm和520nm處的吸光值A(chǔ)650和A520,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測待測樣品 中的S-布洛芬濃度；或者，以R-布洛芬適配體為R-布洛芬的識(shí)別探針，將金納米顆粒溶 液，R-布洛芬適配體溶液、氯化鈉溶液和R-布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，定容，得到標(biāo)準(zhǔn)檢測液， 反應(yīng)30min后，根據(jù)金納米粒子聚沉引起其溶液變色程度的不同，通過紫外分光光度計(jì)檢 則檢測體系在650nm和520nm處的吸光值A(chǔ)650和A520,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢 測待測樣品中的R-布洛芬濃度。
[0009] 優(yōu)選地，所述的S-布洛芬適配體為長度為40bp的單鏈DNA探針，5'端修飾了巰基 (-SH);所述的R-布洛芬適配體為長度為40bp的單鏈DNA探針，5'端修飾了巰基（-SH)。
[0010] 優(yōu)選地，所述的S-布洛芬適配體的序列為：
[0011] 5 ' -SHACAGCGTGGGCGGTGTCGGATTTTCGTATGGATGGGGATG-3 '。
[0012] 優(yōu)選地，所述的R-布洛芬適配體的序列為：
[0013] 5'-SHGCGAACGACTTCATAAAATGCTATAAGGTTGCCCTCTGTC-3'。
[0014] 優(yōu)選地，所述的金納米顆粒溶液的制備方法為：將0. 01 % (w/v)氯金酸水溶液在 油浴中加熱恒溫于92±4°C，在攪拌條件下，加入1% (w/v)檸檬酸三鈉溶液，氯金酸與檸檬 酸三鈉的摩爾比為1 : 300-400,繼續(xù)攪拌，至溶液變成清亮透明的橙紅色或紫紅色，得到 20-30nmol/L的金納米顆粒溶液。
[0015] 更優(yōu)選地，所述的金納米顆粒溶液的制備過程中所用到的玻璃器皿均經(jīng)過徹底清 潔，所述的清潔步驟包括清洗后，用鉻酸洗液或王水充分浸泡24h，后用清水將鉻酸洗液沖 洗干凈，最后用超純水沖洗3-4遍，放入烘箱充分干燥，待用。多次試驗(yàn)證明，玻璃器皿的清 潔是納米金制備成功與否的關(guān)鍵，如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金 顆粒的形成，形成顆粒大小不以、顏色微紅、無色或渾濁不透明的溶液。所以必須在制備金 納米顆粒之前將所有玻璃器皿認(rèn)真清洗。
[0016] 優(yōu)選地，所述的利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測待測樣品中的S-布洛芬濃度的具體步驟包 括將金納米顆粒溶液，S-布洛芬適配體溶液、氯化鈉溶液和待測樣本混合，定容，得到待測 液，反應(yīng)30min后，通過紫外分光光度計(jì)檢則檢測體系在650nm和520nm處的吸光值A(chǔ)650 和A520,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本中S-布洛芬的濃度。
[0017] 優(yōu)選地，所述的利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測待測樣品中的R-布洛芬濃度的具體步驟包 括：將金納米顆粒溶液，R-布洛芬適配體溶液、氯化鈉溶液和待測樣本混合，定容，得到待 測液，反應(yīng)30min后，通過紫外分光光度計(jì)檢則檢測體系在650nm和520nm處的吸光值A(chǔ)650 和A520,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本中R-布洛芬的濃度。
[0018] 優(yōu)選地，所述的待測樣品含有S-布洛芬和R-布洛芬中的至少一個(gè)。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0020] (1)本發(fā)明提供了一種對目標(biāo)布洛芬非常敏感的適配體作為分子識(shí)別元件。與抗 體相比，核酸適配體具有靶分子范圍廣，親合力強(qiáng)，特異性高，穩(wěn)定性好，制備、修飾方便快 速，變性復(fù)性可逆，分子量小，無毒性、無免疫原性、組織滲透性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0021] (2)基于本發(fā)明所述的適配體，制備得到相應(yīng)的適配體電化學(xué)生物傳感器，可以將 樣品中布洛芬目標(biāo)物的存在轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)進(jìn)行快速檢測。它將比色方法的高靈敏性和適配 體高度特異性識(shí)別作用相結(jié)合，制備簡單、靈敏度高、檢測費(fèi)用低、易于微型化、可再生，不 受樣品中其它情況干擾。
[0022] (3)本發(fā)明解決了現(xiàn)有布洛芬檢測成本高、檢測方案復(fù)雜、檢測時(shí)間過長的缺點(diǎn)。 本發(fā)明采用可特異性識(shí)別布洛芬的核酸適配體應(yīng)用于比色分析生物傳感器，大大提高了檢 測的靈敏性和特異性，降低了檢測成本和檢測方案的復(fù)雜性，是一種檢測快速，檢測成本 低，檢測靈敏性高，操作簡單的檢測技術(shù)。
[0023] (4)本發(fā)明為通用型檢測方法，只需要將與金納米粒子非特異性結(jié)合的核酸適配 體探針的序列進(jìn)行相應(yīng)的改變和替換，即可實(shí)現(xiàn)其他目標(biāo)物的快速、現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0024] 圖1是S-布洛芬的單鏈核酸適配體探針在S-布洛芬存在下的透射電鏡圖
[0025] 圖2是R-布洛芬的單鏈核酸適配體探針在R-布洛芬存在下的透射電鏡圖
[0026] 圖3是S-布洛芬適配體探針、R-布洛芬適配體探針分別手性識(shí)別不同濃度的 S-布洛芬、R-布洛芬的A650/A520值。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。各實(shí)施例中制備金納米顆粒所用到的玻璃器皿均經(jīng)過徹底清潔，所述的清潔步驟 包括清洗后，用鉻酸洗液或王水充分浸泡24h，后用清水將鉻酸洗液沖洗干凈，最后用超純 水沖洗3-4遍，放入烘箱充分干燥，待用。
[0028] 實(shí)施例1 :以S-布洛芬適配體探