一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法，屬于傳感分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸適配體aptamer是一段脫氧核糖核酸DNA或者核糖核酸RNA序列，可以通過體外篩選出具有特定序列的一種物質(zhì)，它能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性的結(jié)合。它是一種新型的識別分子，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如可化學(xué)合成、穩(wěn)定性好、沒有毒性。經(jīng)過科研工作者的大量研宄表明，核酸適配體中的堿基“T”和“C”能夠特異性的識別重金屬離子Hg2+和Ag+，從而形成穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”和“C-Ag+-C”結(jié)構(gòu)。研宄者利用這一特殊的結(jié)構(gòu)，設(shè)計了許多檢測Hg2+和Ag +的體系，如熒光、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光以及比色法。
[0003]重金屬，其中的一種定義就是比重大于5的元素都稱之為重金屬，主要包括Au、Ag、Cu、Pb、N1、Co、Cr、Hg、Cd、As等45種，這些重金屬在水體中不能被分解，在微生物的作用下能夠轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的金屬化合物。生物從環(huán)境中提取重金屬，經(jīng)過食物鏈的生物放大作用，在較高級別生物體內(nèi)富集，然后通過食物進(jìn)入人體，危害人體健康。發(fā)生在日本的水俁病和骨痛病分別由重金屬汞和鎘污染造成的。因此，重金屬的檢測顯得尤為重要。
[0004]本發(fā)明利用“T-Hg2+_T”和“C-Ag+_C”結(jié)構(gòu)，設(shè)計不同序列的核酸適配體，采用電化學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)對重金屬離子的檢測。為了加快分析速度，本發(fā)明采用磁性玻碳電極，通過磁性玻碳電極固定鏈霉親和素修飾的磁珠SA-Fe3O4,從而有效增強(qiáng)了電極的穩(wěn)定性，鏈霉親和素和生物素具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，將核酸適配體進(jìn)行生物素標(biāo)記，通過鏈霉親和素和生物素之間的結(jié)合能力，能夠有效的將核酸適配體固定到電極表面，從而增加電極的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是設(shè)計不同序列的核酸適配體，構(gòu)建一種快速、靈敏的電化學(xué)傳感器。
[0006]本發(fā)明的目的之二是將構(gòu)建的電化學(xué)傳感器用于重金屬離子的檢測。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的磁性玻碳電極用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨，接著用蒸餾水將電極表面沖洗干凈后用吸水紙擦干；將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6V掃描，峰電位差小于IlOmV ;滴加6 μ L、l~5 mg/mL的磁珠SA- Fe3O4,靜置晾干；
(2)在步驟(I)修飾的電極表面滴加6yL、200 nmol/L的核酸適配體B1-ssDNA，室溫孵育30 min，接著用pH=7.4Tris-HCl_NaCl緩沖溶液洗工作電極，洗去多余的ssDNA ； (3)將步驟(2)修飾的工作電極浸入到不同濃度的重金屬離子中，保持30 min ; (4)在步驟(3)修飾的工作電極表面滴加3 μ LU.0 mmol/L的硫堇于電極表面，待電極表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗兩次，最后將其放在4 °0冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 所述的磁珠SA-Fe3O4是用鏈霉親和素修飾的；
所述的核酸適配體B1-ssDNA是用生物素標(biāo)記的；
2.重金屬離子的檢測方法
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，將構(gòu)建的基于核酸適配體的電化學(xué)傳感器作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲電極為對電極，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；
(2)用差分脈沖伏安法DPV對重金屬離子進(jìn)行檢測，設(shè)置掃描電位范圍為-0.4-0 V，掃速為0.1 V/s，掃描完成后記錄峰電流的大小，并保存數(shù)據(jù)；
(3)根據(jù)所得的峰電流的大小與重金屬離子濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；
(4)將待測水樣品溶液代替重金屬離子進(jìn)行檢測。
[0008]所述的重金屬離子可以是汞離子Hg2+或者銀離子Ag +。
[0009]本發(fā)明的有益成果
(I)將鏈霉親和素修飾的磁珠引入電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程中，利用磁性玻碳電極，從而增加了修飾電極的穩(wěn)定性。
[0010](2)利用鏈霉親和素與生物素特異性結(jié)合反應(yīng)，增加了電極的穩(wěn)定性。
[0011](3)利用“T-Hg2+-T”及“C-Ag+-C”結(jié)構(gòu)，設(shè)計特定序列的核酸適配體，從而增強(qiáng)了電極對重金屬離子的選擇性，增加了傳感器的特異性。
[0012](4)本發(fā)明制備的電化學(xué)傳感器用于重金屬離子的檢測，具有較高的選擇性和抗干擾能力，檢測限低，線性范圍寬。用于分析汞離子的檢測限為0.33 nmol/L，線性范圍1-200 nmol/L。
[0013]所述的基本試劑與材料均可在試劑公司購買。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的磁性玻碳電極用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨，接著用蒸餾水將電極表面沖洗干凈后用吸水紙擦干。然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ;然后滴加6 yL、l mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，靜置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸適配體B1-ssDNA，室溫孵育30 min，接著用pH=7.4Tris-HCl-NaCl沖洗電極，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)將修飾的工作電極浸入到不同濃度的重金屬離子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇與電極表面，待電極表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗兩次，最后將其放在4 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 所述的磁珠SA-Fe3O4是用鏈霉親和素修飾的；所述的核酸適配體B1-ssDNA是用生物素標(biāo)記的。
[0015]實(shí)施例2—種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法 (1)將直徑為4mm的磁性玻碳電極用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨，接著用蒸餾水將電極表面沖洗干凈后用吸水紙擦干。然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6V掃描，峰電位差小于110 mV ;然后滴加6 μ L、3mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，靜置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸適配體B1-ssDNA，室溫孵育30 min，接著用pH=7.4Tris-HCl-NaCl沖洗電極，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)將修飾的工作電極浸入到不同濃度的重金屬離子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇與電極表面，待電極表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗兩次，最后將其放在4 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 所述的磁珠SA-Fe3O4是用鏈霉親和素修飾的；所述的核酸適配體B1-ssDNA是用生物素標(biāo)記的。
[0016]實(shí)施例3—種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的磁性玻碳電極用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨，接著用蒸餾水將電極表面沖洗干凈后用吸水紙擦干。然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ;然后滴加6 yL、5 mg/mL的磁珠SA-Fe3O4，靜置晾干；
(2)滴加6yL、200 nmol/L的核酸適配體B1-ssDNA，室溫孵育30 min，接著用pH=7.4Tris-HCl-NaCl沖洗電極，洗去多余的B1-ssDNA ；
(3)將修飾的工作電極浸入到不同濃度的重金屬離子中，保持30min ；
(4)滴加3μ LU.0 mmol/L的硫堇與電極表面，待電極表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗兩次，最后將其放在4 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 所述的磁珠SA-Fe3O4是用鏈霉親和素修飾的；所述的核酸適配體B1-ssDNA是用生物素標(biāo)記的。
[0017]實(shí)施例4電化學(xué)傳感器用于重金屬Hg2+的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，將構(gòu)建的基于核酸適配體的電化學(xué)傳感器作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲電極為對電極，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；
(2)用差分脈沖伏安法DPV對Hg2+進(jìn)行檢測，設(shè)置掃描電位范圍為-0.4-0 V，掃速為
0.1 V/s，掃描完成后記錄峰電流的大小，并保存數(shù)據(jù)；
(3)根據(jù)所得的峰電流的大小與Hg2+濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；
(4)將待測水樣品溶液代替Hg2+進(jìn)行檢測。其檢測限為0.33nmol/L，線性范圍1~200nmol/L。
[0018]實(shí)施例5電化學(xué)傳感器用于重金屬Ag+的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，將構(gòu)建的基于核酸適配體的電化學(xué)傳感器作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲電極為對電極，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；
(2)用差分脈沖伏安法DPV對Ag+進(jìn)行檢測，設(shè)置掃描電位范圍為_0.4~0V，掃速為0.1V/s，掃描完成后記錄峰電流的大小，并保存數(shù)據(jù)；
(3)根據(jù)所得的峰電流的大小與Ag+濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；(4)將待測水樣品溶液代替Ag+進(jìn)行檢測。
【主權(quán)項】
1.一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)將直徑為4 mm的磁性玻碳電極用1.0、0.3、0.05 μ m的Al2O3拋光粉打磨，接著用蒸餾水將電極表面沖洗干凈后用吸水紙擦干；將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6V掃描，峰電位差小于IlOmV ;滴加6 μ L、l~5 mg/mL的磁珠SA- Fe3O4,靜置晾干； (2)在步驟(I)修飾的電極表面滴加6yL、200 nmol/L的核酸適配體B1-ssDNA，室溫孵育30 min，接著用pH=7.4Tris-HCl_NaCl緩沖溶液洗工作電極，洗去多余的ssDNA ； (3)將步驟(2)修飾的工作電極浸入到不同濃度的重金屬離子中，保持30min ; (4)在步驟(3)修飾的工作電極表面滴加3 μ LU.0 mmol/L的硫堇于電極表面，待電極表面干后，用Tris-HCl-NaCl溶液清洗兩次，最后將其放在4 °0冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫? 所述的磁珠SA-Fe3O4是用鏈霉親和素修飾的； 所述的核酸適配體B1-ssDNA是用生物素標(biāo)記的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備的一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器用于重金屬離子的檢測，其特征在于，步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，將構(gòu)建的基于核酸適配體的電化學(xué)傳感器作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲電極為對電極，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.80 ~ 8.49的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試； (2)用差分脈沖伏安法DPV對重金屬離子進(jìn)行檢測，設(shè)置掃描電位范圍為-0.4-0 V，掃速為0.1 V/s，掃描完成后記錄峰電流的大小，并保存數(shù)據(jù)； (3)根據(jù)所得的峰電流的大小與重金屬離子濃度的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)將待測水樣品溶液代替重金屬離子進(jìn)行檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，所述的重金屬離子可以是汞離子Hg2+或者銀離子Ag +。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體的重金屬離子電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域?；诤怂徇m配體中特定堿基與金屬離子的特異性結(jié)合，涉及不同序列的核酸適配體，顯著提高了傳感器對金屬離子的選擇性，適應(yīng)于檢測水質(zhì)中的汞和銀；用于分析汞離子的檢測限為0.33 nmol/L，線性范圍為1~200 nmol/L。
【IPC分類】G01N27/48
【公開號】CN104931570
【申請?zhí)枴緾N201510305386
【發(fā)明人】魏琴, 馬洪敏, 閆濤, 吳丹, 范大偉, 龐雪輝, 張勇, 胡麗華, 杜斌
【申請人】濟(jì)南大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月8日