以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05 ~ 100 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0021]實施例3 —種基于G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02i化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備
(I)將直徑為4 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)取6μ?ΛΑ.0 mg/mL的G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02殼聚糖溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加6μ?、12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中干燥；
(4)滴加3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA溶液用以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗電極表面，4 0C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05 ~ 100 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0022]實施例4電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于癌胚抗原CEA的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL，pH 7.5 ~ 8.5的含有0.1 mol/L KCl和20 ~140 mmol/L ￥208的PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；
(2)用MP1-F流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀對分析物進(jìn)行檢測，在底液為10mL，pH 8.0的含有0.1 mol/L KCl和120 mmol/L K2S2Oj^ PBS緩沖溶液中進(jìn)行掃描，掃描電壓范圍為-2~ O V，光電倍增管高壓為750 V，掃描速率為0.1 V s_S
(3)當(dāng)峰值趨于穩(wěn)定后，記錄電化學(xué)發(fā)光光譜。
[0023](4)根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與癌胚抗原CEA濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.05 ~ 100 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
[0024]實施例5電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于甲胎蛋白AFP的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與甲胎蛋白AFP濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.04 ~ 110 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
[0025]實施例6電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于卵巢癌糖類抗原CA125的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與卵巢癌糖類抗原CA125濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.04 ~ 100 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
[0026]實施例7電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原SCCA的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原SCCA濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.06 ~ 100 ng/mL，檢測限為0.03 ng/mL。
[0027]實施例8電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于前列腺特異性抗原PSA的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與前列腺特異性抗原PSA濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.05 ~ 110 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
[0028]實施例9電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于人核基質(zhì)蛋白NMP-22的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與人核基質(zhì)蛋白NMP-22濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.04 ~ 120 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
[0029]實施例10電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于乳腺癌易感基因CA15-3的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與乳腺癌易感基因CA15-3濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.03 ~ 100 ng/mL，檢測限為0.01 ng/mL。
[0030]實施例11電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于糖蛋白抗原CA50的檢測
按照實施例4進(jìn)行操作，根據(jù)所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與糖蛋白抗原CA50濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為0.05 ~ 100 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL。
【主權(quán)項】
1.一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下幾個步驟: (1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)取6 μ?,2.0 ~ 14.0 mg/mL 的 G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02殼聚糖溶液滴加到電極表面，室溫下晚干； (3)滴加6μ?、6 ~ 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體，超純水沖洗電極表面，4 °0冰箱中干燥； (4)滴加3μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I ~ 2%的BSA溶液用以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中晾干； (5)滴加6μ?、0.05 ~ 100 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，所述氧化石墨烯的制備，其特征在于，步驟如下: 將36 mL，98%的硫酸和4 mL，85%的磷酸加入500 mL的三口燒瓶中，用磁力攪拌器攪拌均勻，加入300 mg石墨粉，攪拌；緩慢加入1.8 g的高錳酸鉀粉末；50 T油浴下，磁力攪拌12 h，冷卻至室溫；在攪拌條件下，倒入40 mL冰中；加入300 μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫溶液，并持續(xù)攪拌I h ;以轉(zhuǎn)速9000 r/min，離心分離10 min，去除上清液；用0.2mol/L的鹽酸溶液洗滌沉淀兩遍，無水乙醇洗滌沉淀兩遍，最后用無水乙醚洗滌沉淀一遍；在35 °C下真空干燥12 h;因乙醚的揮發(fā)性較強(qiáng)、容易噴濺，在真空干燥時要將其置于大離心管內(nèi)，用濾紙包裹好，以防噴濺；最終得到黃色固體粉末，用瑪瑙研缽將其研磨、稱重，制得氧化石墨烯。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce0d^]制備，步驟如下: 將100 mg氧化石墨稀粉末溶于100 mL超純水中，超聲2 h ;加入100 mg羧基化碳納米管，超聲I h;加入2.17 g的〇6(勵3)3*6!120，持續(xù)攪拌30 min ;加入10 mg的NaOH，使溶液PH為10，不斷攪拌情況下加入NH3.H2O,使溶液pH為11 ;加入5mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4.4H20溶液，所得懸浮液加熱至80 ° C并維持6 h，離心處理，將得到的沉淀物用超純水和無水乙醇清洗滌3次，產(chǎn)物在40。C真空干燥箱中干燥12 h，于300 °(:管式爐中煅燒I h。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的傳感器用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測方法，其特征在于，步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 7.5 ~ 8.5包含有0.1 mol/L KCl和20 ~ 140 mmol/L K2S2O8^ PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試； (2)用MP1-F流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀對分析物進(jìn)行檢測，在底液為10mL，pH 8.0的含有0.1 mol/L KCl和120 mmol/L K2S2Oj^ PBS緩沖溶液中進(jìn)行掃描，掃描電壓范圍為-2~ O V，光電倍增管高壓為750 V，掃描速率為0.1 V s_S (3)當(dāng)峰值趨于穩(wěn)定后，記錄電化學(xué)發(fā)光光譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于GO/MWCNTs-COOH/AuOCeO2構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，所述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:癌胚抗原CEA、甲胎蛋白AFP、甲狀旁腺激素PTH鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原SCCA、人核基質(zhì)蛋白NMP-22、前列腺特異性抗原PSA、人絨毛膜促性腺激素HCG、酸性磷酸酶ACP、人胎盤催乳素HPL、卵巢癌糖類抗原CA125、乳腺癌易感基因CA15-3、糖蛋白抗原CA50、CA19-9、CA549、CA72-4、細(xì)胞角蛋白、磷化蛋白p53、堿性磷酸酶ALP、神經(jīng)原特異性烯醇化酶NSE、促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH、生長激素GH。
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米功能材料，免疫分析以及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種氧化石墨烯/羧基化碳納米管負(fù)載金摻雜二氧化鈰納米粒子的構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。采用氧化石墨烯/羧基化碳納米管負(fù)載金作為基底材料，二氧化鈰作為發(fā)光材料的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。對腫瘤的早期診斷以及臨床應(yīng)用方面具有重要的實用性。
【IPC分類】G01N33-74, G01N21-76, G01N27-327, G01N33-53, G01N33-573
【公開號】CN104880456
【申請?zhí)枴緾N201510262821
【發(fā)明人】李建修, 魏琴, 馬洪敏, 龐雪輝, 王曉東, 杜斌, 范大偉, 曹偉, 胡麗華, 吳丹, 閆濤, 李月云
【申請人】濟(jì)南大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月22日