構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用GO/MWCNTs-COOH/Au作為基底材料和&02作為發(fā)光材料，制備一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的無標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。腫瘤的發(fā)病率高，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度快，對(duì)人類的健康有極大的危害。腫瘤標(biāo)記物是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的以抗原、酶、激素等形式的代謝產(chǎn)物，并可用于臨床某些腫瘤的診斷和輔助診斷。因此，在臨床研宄上，發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物方法引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]目前已有的腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測(cè)方法很多，如放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析，時(shí)間分辨熒光免疫分析法等。免疫傳感器是將免疫學(xué)方法與分析化學(xué)方法相結(jié)合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性相結(jié)合，使其具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明制備了一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0005]氧化石墨烯和羧基化碳納米管具有比表面積大、導(dǎo)電性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，羧基化碳納米管的水溶性較好，其可提高該電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的穩(wěn)定性。Au NPs能夠提高復(fù)合材料的導(dǎo)電性，從而提高電子傳輸能力。因此本發(fā)明將金納米粒子修飾的氧化石墨烯和羧基化碳納米管引入到免疫傳感器的制備中，利用其比表面積大，電子傳遞能力優(yōu)異等特點(diǎn)，從而起到增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的作用。&02具有低毒，生物相容性好，化學(xué)穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。因此，本發(fā)明利用Au原子的較好的生物相容性，實(shí)現(xiàn)了抗體在電極表面的固定；將復(fù)合材料GO/MWCNTs-COOH/AuOCeOjl入傳感器的制備中，構(gòu)建了一種超靈敏的無標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。&02作為電化學(xué)發(fā)光材料第一次在免疫傳感器中應(yīng)用。復(fù)合材料GO/MWCNTs-C00H/Au@Ce02在檢測(cè)過程中可產(chǎn)生良好的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，有效地降低了傳感器的檢出限，可用于多種腫瘤標(biāo)志物的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，而且制備過程較為簡(jiǎn)單，有效克服了目前腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006](I)基于復(fù)合材料G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02，構(gòu)建了一種無酶、快速且靈敏的無標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0007](2)將該無標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器應(yīng)用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下: 1.一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)取6 μ?,2.0 ~ 14.0 mg/mL 的 G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02殼聚糖溶液滴加到電極表面，室溫下晚干；
(3)滴加6μ?、6 ~ 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體，超純水沖洗電極表面，4 °0冰箱中干燥；
(4)滴加3μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I ~ 2%的BSA溶液用以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05 ~ 100 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0009]2.氧化石墨烯的制備
將36 mL，98%的硫酸和4 mL，85%的磷酸加入500 mL的三口燒瓶中，用磁力攪拌器攪拌均勻，加入300 mg石墨粉，攪拌；緩慢加入1.8 g的高錳酸鉀粉末；50 T油浴下，磁力攪拌12 h，冷卻至室溫；在攪拌條件下，倒入40 mL冰中；加入300 μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫溶液，并持續(xù)攪拌I h ;以轉(zhuǎn)速9000 r/min，離心分離10 min，去除上清液；用0.2mol/L的鹽酸溶液洗滌沉淀兩遍，無水乙醇洗滌沉淀兩遍，最后用無水乙醚洗滌沉淀一遍；在35 °C下真空干燥12 h;因乙醚的揮發(fā)性較強(qiáng)、容易噴濺，在真空干燥時(shí)要將其置于大離心管內(nèi)，用濾紙包裹好，以防噴濺；最終得到黃色固體粉末，用瑪瑙研缽將其研磨、稱重，制得氧化石墨烯。
[0010]3.G0/MWCNTs_C00H/Au@Ce02的制備
將100 mg氧化石墨稀粉末溶于100 mL超純水中，超聲2 h ;加入100 mg羧基化碳納米管，超聲I h;加入2.17 g的〇6(勵(lì)3)3*6!120，持續(xù)攪拌30 min ;加入10 mg的NaOH，使溶液PH為10，不斷攪拌情況下加入NH3.H2O,使溶液pH為11 ;加入5mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4.4H20溶液，所得懸浮液加熱至80 ° C并維持6 h，離心處理，將得到的沉淀物用超純水和無水乙醇清洗滌3次，產(chǎn)物在40。C真空干燥箱中干燥12 h，于300 °(:管式爐中煅燒I h。
[0011]4.多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 7.5 ~ 8.5包含有0.1 mol/L KCl和20 ~ 140 mmol/L K2S2O8^ PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用MP1-F流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)，在底液為10mL，pH 8.0的含有0.1 mol/L KCl和120 mmol/L K2S2Oj^ PBS緩沖溶液中進(jìn)行掃描，掃描電壓范圍為-2~ O V，光電倍增管高壓為750 V，掃描速率為0.1 V s_S
(3)當(dāng)峰值趨于穩(wěn)定后，記錄電化學(xué)發(fā)光光譜。
[0012]5.上述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:癌胚抗原CEA、甲胎蛋白AFP、甲狀旁腺激素PTH鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原SCCA、人核基質(zhì)蛋白NMP-22、前列腺特異性抗原PSA、人絨毛膜促性腺激素HCG、酸性磷酸酶ACP、人胎盤催乳素HPL、卵巢癌糖類抗原CA 125、乳腺癌易感基因CA15-3、糖蛋白抗原CA50、CA 19-9, CA549、CA72-4、細(xì)胞角蛋白、磷化蛋白p53、堿性磷酸酶ALP、神經(jīng)原特異性烯醇化酶NSE、促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH、生長(zhǎng)激素GH。
[0013]本發(fā)明的有益成果
(I )GO/MWCNTs-COOH具有較大的表面積能夠增加Au NPs在其表面的負(fù)載量，進(jìn)而增加抗體的負(fù)載量，此外，其電子傳導(dǎo)能力優(yōu)異，引入到電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器中，使傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)。
[0014](2)Ce02—步還原到基底材料 GO/MWCNTs-COOH 上，復(fù)合材料 G0/MWCNTs-C00H/Au@&02制備較為簡(jiǎn)單。CeO2具有強(qiáng)而穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，在免疫傳感器中第一次作為電化學(xué)發(fā)光材料得以應(yīng)用。
[0015](3) MWCNTS-C00H的使用，既利用其較大比表面積和良好的電子傳導(dǎo)能力，又可增大基底材料的水溶性，使其具有更為穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而較好的提高傳感器的穩(wěn)定性。
[0016](4)將殼聚糖應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，利用其優(yōu)異的成膜性能，防止了復(fù)合材料G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02從電極表面上脫落，同時(shí)利用殼聚糖具有很好的生物相容性和低毒性，有利于抗體在電極表面的固定。
[0017](5)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測(cè)方法的特異性。
[0018](6)本發(fā)明制備的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)限低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和特異性檢測(cè)，對(duì)常見腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)限可達(dá)0.02 ng/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1 一種基于G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02i化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)取6μ?、2.0 mg/mL的G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02殼聚糖溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加6PL、6Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中干燥；
(4)滴加3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的BSA溶液用以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗電極表面，4 0C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.05 ~ 100 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得一種基于G0/MWCNTS-C00H/Au@Ce02構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0020]實(shí)施例2 —種基于G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02i化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)取6μ?,8.0 mg/mL的G0/MWCNTs-C00H/Au@Ce02殼聚糖溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加6μ?、10 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體，超純水沖洗電極表面，4 °C冰箱中干燥；
(4)滴加3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的BSA溶液用