β-分泌酶特異性抑制劑的篩選方法及其篩選系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抑制劑的篩選方法及其篩選系統(tǒng)，特別是設(shè)及一種0-分泌酶 炬AC巧特異性抑制劑的篩選方法及其篩選系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 已有大量證據(jù)表明淀粉樣蛋白（A0)在中樞系統(tǒng)的異常聚集和沉積有神經(jīng)毒性， 并可導(dǎo)致阿爾茲海默（Alzheimer'S)病的發(fā)生。A0是通過0-分泌酶炬AC巧和丫-分 泌酶對淀粉樣前體蛋白（APP蛋白）的逐步水解作用形成的。其中，BACE是A0生成的限速 步驟。針對BACE的抑制劑被認(rèn)為是最有希望成為治療和預(yù)防Alzheimer's病的藥物。全 球多家制藥公司正圍繞BACE抑制劑的篩選開展激烈的競爭。人們通過結(jié)構(gòu)分析W及分子 設(shè)計(jì)，已經(jīng)獲得了數(shù)W萬計(jì)的有希望成為BACE抑制劑的化合物分子。但如何從中篩選到能 有效抑制BACE水解APP產(chǎn)生A0的活性，又不影響B(tài)ACE的其他正常生理活性的真正有意 義的前導(dǎo)藥物，成為困擾BACE抑制劑研究的難點(diǎn)。
[000引 目前BACE抑制劑的篩選方法，基本都是利用BACE酶切位點(diǎn)的多膚序列為底物。在 酶切位點(diǎn)的中間引入巧光澤滅基團(tuán)，多膚的一端引入巧光基團(tuán)，根據(jù)巧光共振能量轉(zhuǎn)移原 理，巧光基團(tuán)的發(fā)射光被澤滅基團(tuán)吸收。多膚在BACE酶切作用下兩種基團(tuán)分離，巧光基團(tuán) 的發(fā)射光可被檢測到。
[0004] 然而由于多膚不具有空間結(jié)構(gòu)，不能完全反應(yīng)蛋白底物與蛋白酶相互作用時(shí)的選 擇性。因此，W多膚為底物篩選到的BACE抑制劑，往往不具備選擇性，它們會對BACE的蛋 白酶活性不加區(qū)別地抑制。該勢必造成該些抑制劑在阻斷A0產(chǎn)生的同時(shí)，影響了BACE對 其它底物的正常加工作用?；蛘邥绊態(tài)ACE同一家族的其它蛋白酶的活性。該些都會導(dǎo) 致嚴(yán)重的副作用。
[0005] ChengquanZhang等人報(bào)道(ChengquanZhang,LiZheng,etal.Cleavage ofpro-tumornecrosisfactoralphabyADAMmetallopeptidasedomain17:Af； iprescemce-basedproteaseassaycleavesitsnaturalproteinsubstrate. Anal}fticalBiochemistry, 2014 445:14-19;)利用TACE的天然底物TNFa為勒1 標(biāo)，可W篩選到通過抑制TNFaS聚體形成而阻斷TACE-TNFa加工途徑的化合物，該種化合物并不 影響TACE對其多膚底物的酶切活性。證明了用蛋白質(zhì)做底物可W提高化合物篩選的精確 度。
[0006] 因此，對0 -分泌酶特異性抑制劑的篩選方法有待進(jìn)一步研究的價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種0 -分泌酶特異性抑制劑的篩選體系。
[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種0 -分泌酶特異性抑制劑的篩選方法。
[0009] 該篩選方法是根據(jù)巧光共振能量轉(zhuǎn)移原理，用帶有量子點(diǎn)標(biāo)記的微膠束包裝帶有 巧光定點(diǎn)標(biāo)記的淀粉樣前體蛋白（APP蛋白）。微膠束一方面可W維持APP蛋白空間構(gòu)象， 另一方面又可W對APP蛋白起拘束作用，從而使得量子點(diǎn)和APP蛋白之間可形成巧光共振 能量轉(zhuǎn)移。該種能量轉(zhuǎn)移將會由于BACE對APP蛋白的酶切，APP蛋白帶有巧光標(biāo)記的部分 與膠束的分離而消失。因此，可W通過記錄巧光信號，實(shí)時(shí)定量檢測各種化合物對BACE作 用的影響。本發(fā)明的特征是，WBACE天然底物分子作為祀標(biāo)，保證了篩選到的藥物前導(dǎo)分 子具有更精確的底物特異性。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0011] 在本發(fā)明的一方面，提供一種0-分泌酶特異性抑制劑的篩選體系，該體系為微 膠束溶液包裹帶有巧光標(biāo)記的APP蛋白形成的微膠束-APP體系；所述APP蛋白為淀粉樣前 體蛋白；所述微膠束溶液采用經(jīng)過兩親性聚合物分子修飾的量子點(diǎn)制得；所述帶有巧光標(biāo) 記的APP蛋白是利用正交反應(yīng)體系，對APP蛋白進(jìn)行定點(diǎn)巧光標(biāo)記制得。
[0012] 進(jìn)一步地，所述兩親性聚合物分子，是WC18長燒姪鏈為骨架，接枝上帶有親水性 頭部的兩親性分子；親水性頭部包括；多己胺，聚丙締酸，短鏈多聚極性氨基酸，乳糖，甘露 醇；所述量子點(diǎn)是一種巧光納米顆粒，包括II-VI族油相合成量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)的粒徑為 5nm~lOnm，發(fā)射波長控制在490nm~510nm。
[0013] 進(jìn)一步地，所述微膠束溶液中的微膠束的粒徑范圍為100~200nm;;所述帶有巧 光標(biāo)記的APP蛋白與所述微膠束溶液W表面活性劑分子計(jì)算的摩爾比為1 ; 1~1:10 ;所述 巧光標(biāo)記包括激發(fā)波長范圍與量子點(diǎn)發(fā)射波長范圍重疊的巧光核。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種0-分泌酶特異性抑制劑的篩選方法，包括如下 步驟：
[0015] 1)用經(jīng)過兩親性聚合物分子修飾的量子點(diǎn)制備微膠束溶液（即量子點(diǎn)微膠束溶 液）；
[0016] 2)利用正交反應(yīng)體系，對淀粉樣前體蛋白（APP蛋白）進(jìn)行定點(diǎn)巧光標(biāo)記；
[0017] 3)用步驟1)的微膠束溶液包裹步驟2)的帶有巧光標(biāo)記的APP蛋白，W形成微膠 束-APP體系；
[001引 4)利用微膠束-APP體系篩選具有BACE活性抑制作用的化合物。
[0019] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中，量子點(diǎn)是一種巧光納米顆粒，本發(fā)明采用易于制備，且 巧光效率高的II-VI族油相合成量子點(diǎn)，如CdTe、CdSe、CaS、CaSe、BaS、BaTe等；該量子點(diǎn) 的制備方法，可根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行制備。另外，本發(fā)明中的量子點(diǎn)的粒徑優(yōu)選為5nm~ lOnm，發(fā)射波長控制在490nm~510nm。
[0020] 步驟1)中，量子點(diǎn)表面修飾所使用的兩親性聚合物分子，是WC18長燒姪鏈，如腦 磯脂等為骨架，接枝上帶有親水性頭部的兩親性分子。親水性頭部包括；多己胺，聚丙締酸， 短鏈多聚極性氨基酸，乳糖，甘露醇等。接枝方法；取長燒姪鏈分子溶于二甲基亞 諷值MS0)或二甲基甲酯氨值MF)中，加入8mM的N，N'-二環(huán)己基碳化二亞胺值CC)和8mM 的N-哲基了二酷亞胺（N服），0°C下反應(yīng)12虹，使長燒姪分子活化。取0. 02mM~0. 74mM的極 性分子如聚丙締酸，半乳糖，甘露糖等溶于氯仿-甲醇溶液（V氯仿；V甲醇=3:1)中，緩慢 加熱至35°C，逐漸滴加入到上述0. 04mM~ImM已活化好的燒姪分子溶液中，并加入3mMS 己胺，保持體系在35°C下反應(yīng)12虹，即得到可用于量子點(diǎn)表面修飾的兩親性化合物分子。
[0021] 步驟1)中，量子點(diǎn)標(biāo)記的微膠束的合成具體操作可包括步驟：
[002引將1ymol的量子點(diǎn)溶于氯仿-甲醇（V氯仿；V甲醇=3 ;1)的溶劑中，加入100~ 900倍摩爾數(shù)量的兩親性聚合物分子，在50~80°C下混合，并蒸發(fā)除去多余的有機(jī)溶劑。 將得到的固體分散到超純水中，高速離屯、，取上清，除去團(tuán)聚的、未被修飾的量子點(diǎn)。過濾上 清。
[0023] 所述過濾中的濾膜包括；孔徑為100~200nm的聚碳酸醋濾膜；
[0024] 微膠束溶液中的微膠束的粒徑范圍優(yōu)選為100~200nm。
[00巧]進(jìn)一步地，所述步驟2)中，帶有巧光定點(diǎn)標(biāo)記的淀粉樣前體蛋白，是通過基于密 碼子拓展的生物正交標(biāo)記系統(tǒng)完成的。如圖4所示，具體的合成方法包括：
[0026] a)構(gòu)建含班巧抑制型tRNAiyScuA基因的質(zhì)粒
[0027] 提取嗜熱古細(xì)菌基因組DNA，通過PCR的方法擴(kuò)增獲得班巧抑制型MjtRNAiys。。,的 基因，并將其克隆至含有大腸桿菌谷氨酷胺-tRNA啟動(dòng)子的且?guī)в锌敲顾乜剐缘谋磉_(dá)質(zhì) 粒PAC123中（通過EocRI/PstI位點(diǎn)插入到PAC123質(zhì)粒）。
[0028] 其中，嗜熱古細(xì)菌班巧抑制型tRNAiyScuA的基因擴(kuò)增引物為：
[0029] 5' 端上游引物序列；5' -GGAATTCCCGGCGGTAGTTCAG-3'，如SEQIDNo. 1 所示；
[0030] 3' 端下游引物序列；5' -AAACTGCAGTGGTCCGGC-3'，如SEQIDNo. 2 所示；
[0031] b)構(gòu)建tRNAPydyscUA-pyrlysRS(氨酷t(yī)RNA合成酶）體系，其中，步驟b)的具體操 作可包括步驟：
[0032] bl)W嗜熱古細(xì)菌的lys氨酷t(yī)RNA合成酶基因?yàn)槟０澹槍ys-tRNA合成酶上 參與催化氨基酸-tRNA合成的關(guān)鍵位點(diǎn)41A、268N，通過設(shè)計(jì)兼并引物，W及反向PCR，獲得 pyrlysRS的突變質(zhì)粒文庫；
[003引其中，PCR擴(kuò)增中的兼并引物序列如下；
[0034] 5,端上游引物序列；5,-aagtggtaaannncatttagggc-3,，如SEQIDNo. 3 所示；
[OOW] 3,端下游引物序列；5,-atttgacagttnnnagctatga-3,，如SEQIDNo. 4 所示