專(zhuān)利名稱(chēng)：基于酶抑制反應(yīng)的飲用水中無(wú)機(jī)砷檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分析測(cè)試領(lǐng)域，涉及一種基于乙酰膽堿酯酶抑制反應(yīng)檢測(cè)水中無(wú)機(jī)砷含量的裝置的研制。本裝置主要由蠕動(dòng)泵，膜式反應(yīng)器，檢測(cè)器，信號(hào)分析系統(tǒng)，以及分析試劑包組成。檢測(cè)時(shí)，在特殊設(shè)計(jì)的膜式反應(yīng)器內(nèi)，以干粉形式吸附固定在醋酸纖維素薄膜上的乙酰膽堿酯酶解析成游離態(tài)酶，并與樣品中的亞砷酸根反應(yīng)，其活性被抑制。通過(guò)測(cè)定酶活性的抑制率即可得出樣品中的亞砷酸根濃度。通過(guò)還原試劑將水中的砷酸根還原為亞砷酸根可以實(shí)現(xiàn)水中總無(wú)機(jī)砷含量的測(cè)定。本裝置對(duì)水中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)限為20ppb，線性范圍為50-1000ppb。本裝置可用作飲用水或地下水中無(wú)機(jī)砷含量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
本技術(shù)領(lǐng)域的背景及發(fā)展現(xiàn)狀大致如下飲用水造成的低劑量砷暴露在世界各地普遍存在。當(dāng)前砷的檢測(cè)主要依靠AAS、AFS、ICP-MS，ICP-AES等現(xiàn)代大型分析儀器。這些儀器雖然具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是由于價(jià)格昂貴和難以小型化，所以只能將樣品處理后在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測(cè)。由于砷中毒多發(fā)生在以地下水為飲用水水源的農(nóng)村，需要檢測(cè)的水源多而分散，并且砷酸根離子在地下水中的遷移敏感性非常強(qiáng)，即使對(duì)于同一口水井來(lái)說(shuō)，砷的濃度也在逐漸變化之中，所以?xún)H僅依靠大型分析儀器難以對(duì)飲用水中的砷含量進(jìn)行有效監(jiān)控，為此，迫切需要開(kāi)發(fā)小型化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)儀器和方法。目前應(yīng)用最多的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法是化學(xué)試劑條法。該方法的主要原理是通過(guò)向樣品溶液中加入還原性試劑，通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)將砷還原為砷化氫氣體，然后砷化氫氣體被檢測(cè)條捕集，并與上面的顯色劑反應(yīng)，最后通過(guò)比色來(lái)測(cè)定原來(lái)水溶液中砷的濃度。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速，并且有商品化檢測(cè)條或試劑盒出售，缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度差(100ppb)，并且反應(yīng)產(chǎn)生的劇毒砷化氫氣體有可能對(duì)操作者的健康構(gòu)成威脅。目前類(lèi)似本發(fā)明的裝置尚未見(jiàn)報(bào)道。有關(guān)這方面的文獻(xiàn)可參見(jiàn)1.D.Chakraborti et al，Talanta 2002，583-222.A.M.Featherstone，et al.，Anal.Chim.Acta 2000，4092153.Stoytcheva，et al.，Electroanalysis，1998，10994-9984.A.Hussam，et al.，Environ.Sci.Technol.，2000，33(20)3686-36885.D.K.Nordstrom，Sicence 2002，2962143-2145本發(fā)明的目的是提供一種基于亞砷酸根對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用的流動(dòng)注射分析裝置。本裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于攜帶、成本低廉，可以用于水源砷含量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，其穩(wěn)定性和重復(fù)性可以滿足定量分析的要求。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的膜式反應(yīng)器和相應(yīng)流動(dòng)注射分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

圖1是膜式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，A為膜式反應(yīng)器側(cè)剖圖，B為酶膜部分局部放大圖，C為反應(yīng)器內(nèi)表面液槽示意圖。圖中數(shù)字所標(biāo)出的各部分組件分別為1，帶螺紋和螺扣的反應(yīng)器外殼；2，聚四氟乙烯支撐體；3，塑料箍；4，尼龍膜；5，半透膜；6，酶膜；7，硅膠墊圈。圖2是流動(dòng)注射分析系統(tǒng)原理圖。其中，1為樣品，2為緩沖液，3為底物和顯色劑溶液，4為蠕動(dòng)泵，5為膜式反應(yīng)器，6為檢測(cè)器。檢測(cè)時(shí)，首先將固定化了酰膽堿酯酶的醋酸纖維素膜裝入圖1所示的膜式反應(yīng)器，然后將此反應(yīng)器接入圖2所示的流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，并用空白緩沖液平衡20分鐘，此時(shí)，乙酰膽堿酯酶從醋酸纖維素膜上解吸，并在醋酸纖維素膜和半透膜之間形成一高濃度的酶層，這有助于在樣品測(cè)定時(shí)減少乙酰膽堿酯酶-亞砷酸根復(fù)合物的解離。儀器穩(wěn)定后，注入一定量酶反應(yīng)底物及顯色劑，記錄此時(shí)儀器的空白響應(yīng)值。用25毫升注射器取20毫升樣品溶液，用裝有0.45微米微孔濾膜的針頭過(guò)濾器過(guò)濾。首先向?yàn)V液中加入含碘化鉀的試劑包，將溶液中的砷酸根還原為亞砷酸根，然后向?yàn)V液中加入包含定量碘解磷定、乙二胺四乙酸鈉、磷酸鹽的分析試劑包，振蕩，使試劑充分溶解及混勻。在溶液中添加碘解磷定的原因是因?yàn)檎Ｇ闆r下亞砷酸根與乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)非常緩慢，而加入碘解磷定以后其反應(yīng)速度可提高220倍，同時(shí)碘解磷定又是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)毒劑的解毒劑，所以在溶液中加入碘解磷定既可以增加亞砷酸根與乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)速度，又可以防止樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)毒劑的干擾。另外，由于一些重金屬陽(yáng)離子也可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，因此在溶液中加入一定量乙二胺四乙酸鈉以防止樣品中重金屬陽(yáng)離子對(duì)測(cè)定的干擾。經(jīng)過(guò)上述處理后的樣品溶液以0.3毫升/分鐘的流速，通過(guò)膜式反應(yīng)器，樣品中的亞砷酸根與膜式反應(yīng)器中的乙酰膽堿酯酶結(jié)合，使乙酰膽堿酯酶的活性被抑制。由于樣品溶液中一些可能存在的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)毒劑以及重金屬陽(yáng)離子對(duì)乙酰膽堿酯酶的影響已被屏蔽，所以乙酰膽堿酯酶活性的被抑制率只與溶液中亞砷酸根的濃度成正相關(guān)。反應(yīng)進(jìn)行20分鐘后，注入一定量酶反應(yīng)底物及顯色劑，讀取儀器的響應(yīng)值，并與空白響應(yīng)值比較，計(jì)算出乙酰膽堿酯酶的抑制率，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品中砷的含量。
圖3是基于酶抑制反應(yīng)的飲用水無(wú)機(jī)砷檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1為樣品瓶，2為緩沖液瓶，3為三通閥，4為蠕動(dòng)泵，5底物進(jìn)樣閥，6為溫控器，7為加熱棒，8為膜式反應(yīng)器，9為檢測(cè)池，10為發(fā)光二極管，11為光電倍增管，12為數(shù)模轉(zhuǎn)換器，13為變壓器。由此圖可以看出，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于攜帶、成本低廉，適用于對(duì)農(nóng)村或野外的地表水、井水、地下水中的砷含量進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
在完成本發(fā)明的過(guò)程中，對(duì)分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條件如下AchE濃度0.2u/ml，2-PAM濃度1×10-4mol/L，pH值7.4，反應(yīng)溫度25℃，離子強(qiáng)度0.2mol/L，反應(yīng)時(shí)間20min。在優(yōu)化的條件下，本方法的檢測(cè)限為20ppb，線性區(qū)間為50-1000ppb。以自來(lái)水為樣品進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)低濃度(50ppb)和高濃度(1000ppb)的回收率分別為88.1％和95.0％，我們還考察了實(shí)驗(yàn)條件下，As(V)、對(duì)硫磷、馬拉硫磷、Fe3+、Ni2+、Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ge2+、Pb2+等對(duì)測(cè)量的影響，結(jié)果表明，除Cu2+在500ppb時(shí)對(duì)AchE的抑制率達(dá)10％外，其它化合物在1ppm濃度以?xún)?nèi)對(duì)AchE的抑制率均小于10％，因此，本方法對(duì)AsO33-的檢測(cè)具有很高的特異性。
權(quán)利要求
1.一種基于酶抑制反應(yīng)的飲用水無(wú)機(jī)砷檢測(cè)裝置，其特征是使用吸附法將乙酰膽堿酯酶以干粉形式固定在載體膜上，便于儲(chǔ)存或運(yùn)輸。檢測(cè)時(shí)固定化酶從載體膜上解吸附，以游離態(tài)酶參與反應(yīng)。
2.按照權(quán)利要求書(shū)1所述的檢測(cè)裝置，其特征是使用半透膜或超濾膜將乙酰膽堿酯酶限制在很小的體積內(nèi)，形成高濃度溶液。
3.按照權(quán)利要求書(shū)1所述的檢測(cè)裝置，其特征是在樣品溶液中加入碘解磷定以增加亞砷酸根與乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)速度，并防止樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)毒劑的干擾。
4.按照權(quán)利要求書(shū)1所述的檢測(cè)裝置，其特征是在樣品溶液中加入乙二胺四乙酸鈉以防止樣品中重金屬陽(yáng)離子對(duì)測(cè)定的干擾。
全文摘要
本發(fā)明屬分析測(cè)試領(lǐng)域，涉及一種基于乙酰膽堿酯酶抑制反應(yīng)檢測(cè)水中無(wú)機(jī)砷含量的裝置的研制。本裝置主要由蠕動(dòng)泵，膜式反應(yīng)器，檢測(cè)器，信號(hào)分析系統(tǒng)，以及分析試劑包組成。檢測(cè)時(shí)，在特殊設(shè)計(jì)的膜式反應(yīng)器內(nèi)，以干粉形式吸附固定在醋酸纖維素薄膜上的乙酰膽堿酯酶解析成游離態(tài)酶，并與樣品中的亞砷酸根反應(yīng)，其活性被抑制。通過(guò)測(cè)定酶活性的抑制率即可得出樣品中的亞砷酸根濃度。通過(guò)還原試劑將水中的砷酸根還原為亞砷酸根可以實(shí)現(xiàn)水中總無(wú)機(jī)砷含量的測(cè)定。本裝置對(duì)水中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)限為20ppb，線性范圍為50－1000ppb。本裝置可用作飲用水或地下水中無(wú)機(jī)砷含量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N35/08GK1415967SQ0214643
公開(kāi)日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者江桂斌, 時(shí)國(guó)慶, 王倩杏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心