外周血血漿蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的拉曼、紅外或拉曼-紅外分析及其與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知發(fā)育 ...的制作方法
【專利說明】外周血血漿蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的拉曼、紅外或拉曼-紅外分析及 其與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知發(fā)育的關(guān)系 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過振動光譜法（FT-拉曼、FT-紅外或FT-拉曼組合FT-紅外）分析 血漿蛋白質(zhì)的新方法，從而證明二級和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與阿爾茨海默氏癥（AD)的認(rèn)知發(fā) 育之間存在相關(guān)性，主要應(yīng)用領(lǐng)域是健康領(lǐng)域。本發(fā)明具體地涉及基于振動光譜法診斷AD 的診斷方法，并且其還可有助于與該光譜法儀器相關(guān)的商業(yè)領(lǐng)域。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 預(yù)計(jì)患有癡呆的人數(shù)，在2000年世界范圍內(nèi)有2500萬，由于人口結(jié)構(gòu)變化和壽命 增加，將在2030年增加至6300萬并在2050年增加至1億1400萬。存在廣泛的復(fù)雜神經(jīng) 變性障礙，其特征均在于神經(jīng)元功能失調(diào)最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，這與這些疾病發(fā)展相關(guān)。阿 爾茨海默氏癥（AD)是最常見的。已計(jì)算出超過一半癡呆患者患有AD，并且這個數(shù)字將每 二十年翻倍。雖然神經(jīng)變性癡呆的臨床癥狀通常與最受影響的腦區(qū)域有關(guān)，但混合病理的 發(fā)作是普遍的，并且早期臨床表現(xiàn)通常是相似的。此外，單一類型的病理可能產(chǎn)生不同的認(rèn) 知結(jié)果，使得診斷艱難。存在證據(jù)證明表示癡呆的疾病病理變化在首次臨床表現(xiàn)發(fā)作之前 數(shù)十年就開始。找到AD和其他癡呆的有效治療的挑戰(zhàn)與探索臨床前變化的盡可能早的檢 測和準(zhǔn)確鑒定負(fù)有責(zé)任的病理（一個或多個）并行。
[0004] 因此，這些考慮對社會和健康系統(tǒng)提出巨大的挑戰(zhàn)，以及因此提出允許早期檢測 這些疾病從而給予適當(dāng)治療和準(zhǔn)確跟蹤其進(jìn)展的生物標(biāo)記的研宄的需要。當(dāng)前最有效決 定性AD診斷限于尸檢，并且臨床診斷通過在專家分析癡呆是否存在并且未找到解釋癡呆 病因的征兆或癥狀后的排除完成。有三個領(lǐng)域其中已經(jīng)在理論上或在實(shí)踐上獲得可用于建 立如下診斷測試的結(jié)果：遺傳學(xué)、生物標(biāo)記檢測/定量、神經(jīng)成像。這些方式全部一一其中 一些非常昂貴，如神經(jīng)成像一一已經(jīng)取得一定成功，但仍未提供在醫(yī)療實(shí)踐中需要的超過 80 %的診斷可靠度和特異性的診斷方案。AD提出很多問題，包括早期診斷和跟蹤患者進(jìn)展、 以及確定性死后診斷和神經(jīng)病理變化表征。這些全部需要建立靈敏的、可靠的、簡單實(shí)施和 重復(fù)的和低成本的方法。
[0005] 即使AD的病因是未知的并且正在討論關(guān)于導(dǎo)致AD最終神經(jīng)變性階段的"一個 /多個致病事件的一個/多個級聯(lián)"，但關(guān)于退化過程一一發(fā)生從而能夠限定指示疾病的 可能的生物標(biāo)記一一有著足夠的知識。眾所周知AD的最重要的病理特征其中之一是腦 中的纖維狀蛋白質(zhì)的積累，其表現(xiàn)為（神經(jīng)元外）衰老斑和（神經(jīng)元內(nèi)）神經(jīng)原纖維纏 結(jié)形成一一其主要組分是Af3 -淀粉狀肽。一些作者已經(jīng)證實(shí)外周血一一其是容易提取 的生物學(xué)流體一一中一些淀粉狀肽的濃度與疾病特定階段或患病風(fēng)險相關(guān)，在一些情況 下具有預(yù)測價值（Graff-Radford等，Arch.Neurol. 64, 354-62 (2007) ;Baranowska_Bik 等，Neuro.Endocrinol.Lett. 29, 75-79 (2008);Modrego等，Am.J.AlzheimersDis.Other Demen. 23,286-290(2008))。在其他研宄中，已發(fā)現(xiàn)某些與氧化應(yīng)激有關(guān)的生物標(biāo)記， 自由基或過氧化大分子（血細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)或生成或中和自由基的系統(tǒng)（超 氧化物歧化酶等），在阿爾茨海默氏癥患者的血液中增加（Baldeiras等，Alzheimers Dis. 15, 117-128 (2008);Bermejo等，F(xiàn)reeRad.Res. 42, 162-170 (2008);Greibelger等，F(xiàn)reeRad.Res. 42, 633-638(2008))〇
[0006] 在大量研宄實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)中，振動光譜法具有快速、非侵入性和相對低成 本的優(yōu)勢。其還提供關(guān)于生物學(xué)系統(tǒng)分子組分的分析和結(jié)構(gòu)信息，這使其可用于這些 應(yīng)用。拉曼光譜法已被用于AD診斷，通過測量腦組織的光譜、淀粉狀0肽沉積物、膽 固醇的增加和高磷酸化tau蛋白--其被發(fā)現(xiàn)作為生物學(xué)變化（Archer等，European ConferenceonBiomedicalOptics(ECBO)，慕尼黑，德國，2007;Chen等，Appl.Optics48， 4743-4748(2009))。然而，該工作忽略了這種技術(shù)在檢測腦組織的AD中的特異性和靈敏 性，此外該組織不如外周血般可獲得，而外周血已知是容易提取的生物學(xué)流體。此外，腦組 織中發(fā)生的變化不一定在外周血中也要發(fā)生。
[0007] 拉曼光譜法也已以AD診斷為目的被用于研宄外周血血小板（Chen等，Laser Phys.Lett. 8,547_552(2011))。然而，該文章的確顯現(xiàn)下列缺陷：
[0008] _633nm激發(fā)激光線的使用，如同其他可見光譜的激光線，可在生物學(xué)物質(zhì)中產(chǎn)生 熒光，其至少部分地遮蓋在議樣品的拉曼光譜，并且使其隨后的分析無用。由于拉曼共振效 應(yīng)，利用可見光譜激光線的拉曼激發(fā)可引起有色少數(shù)血漿組分（類胡蘿卜素、膽紅素、血紅 蛋白）的帶大幅強(qiáng)化，這可很大程度上遮蓋該部分的多數(shù)組分（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）。而且，如果 這些有色少數(shù)組分的含量飄忽不定，則隨后的強(qiáng)拉曼信號也會飄忽不定，這將因此使得正 確的樣品分類復(fù)雜。因此，需要使用更實(shí)用的激光用于診斷目的，和與傅立葉變換-拉曼光 譜儀（FT-拉曼光譜儀）相關(guān)的近紅外激發(fā)，使多數(shù)樣品的熒光概率最小化（Applications ofVibrationalSpectroscopyinPharmaceuticalResearchandDevelopment". Chichester，WestSussex，英國，2007, 353-362)。
[0009] _在該文章中通過拉曼光譜法分析的血小板樣品來自轉(zhuǎn)基因小鼠，其蛋白質(zhì)與 人蛋白質(zhì)不一致。因此，這些嚙齒動物的AD進(jìn)程中的分析-結(jié)構(gòu)變化可能與人外周血中 發(fā)生的那些不同，如本發(fā)明中已經(jīng)證明。此外，所述光譜法血小板研宄中的樣品尺寸很 ?。?0個AD小鼠和8個健康對照），和當(dāng)前患有AD的小鼠轉(zhuǎn)基因模型中沒有一個可與患 有該疾病的人類完全可比（Wisniewski和Sigurdssson，Biochim.Biophys.Acta1802， 847-859(2010))〇
[0010] 進(jìn)而并且以診斷AD為目的，還已利用單核白細(xì)胞的透射紅外（IR)光譜法 (Carmona等，Anal.Bioanal.Chem.402,2015-2021(2012))。通過利用 0 折疊結(jié)構(gòu)百分比 作為單一診斷參數(shù)，在分類屬于健康對照組以及患有輕度、中度和重度AD的患者組的樣品 時所得靈敏度接近80 %。然而，從這個意義來講，單獨(dú)紅外光譜法相對于可如下描述的拉曼 光譜法具有缺陷。即使在室溫下在干燥樣品中發(fā)現(xiàn)少量的水，其也導(dǎo)致850cm1以下的背景 吸收遮蓋了在議樣品的生物學(xué)物質(zhì)的帶。這意味著在紅外中可用于樣品分析的光譜范圍短 于在拉曼中，因此提供較少信息。此外，在大分子結(jié)構(gòu)的固有因素和光譜法選擇規(guī)則中，必 須指出紅外是提供關(guān)于二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，而非關(guān)于包含色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、胱 氨酸/半胱氨酸的側(cè)鏈的三級結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)。
[0011] 因此，需要建立能夠發(fā)現(xiàn)與阿爾茨海默氏癥相關(guān)的認(rèn)知惡化關(guān)聯(lián)的血液蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)和氧化應(yīng)激模式、能夠更精確地區(qū)分所述疾病的狀態(tài)的分析技術(shù)。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明涉及外周血血漿樣品的拉曼、紅外或拉曼/紅外分析以及與阿爾茨海默氏 癥的認(rèn)知發(fā)育的相關(guān)性。如實(shí)施例1和2所示，現(xiàn)有的血液樣品分級可用于實(shí)施本發(fā)明的方 法，這些分級的樣品被收集在肝素化管中并進(jìn)行離心。將約50微升的上清液沉積在樣品盛 放器上并在室溫下干燥約30分鐘。在均質(zhì)化后測量所得固體樣品的拉曼光譜。使光譜標(biāo) 準(zhǔn)化，并且校正基線，從而隨后確定由AD進(jìn)程中淀粉狀0肽形成和/或二級和三級蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)的變化引起的光譜法參數(shù)（頻率、帶高度比和面積）變化。隨后對光譜法參數(shù)進(jìn)行判 別式分析，這基于使某些光譜區(qū)域與AD存在或不存在關(guān)聯(lián)。拉曼光譜法中的這些區(qū)域是酰 胺I區(qū)域（nOO-ieOOcnT1)、980和910CHT1之間包括的區(qū)域（包括a-螺旋的一般C-C伸縮 帶）、具有色氨酸殘基的三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的760-730CHT1區(qū)域、角變形的450-390CHT1區(qū)域、 和3100和2800CHT1之間包括的C-H伸縮區(qū)域。紅外光譜法中適當(dāng)?shù)膮^(qū)域是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 酰胺I區(qū)域（1700-160001^)和1150和lOOOcnT1之間包括的氧化應(yīng)激區(qū)域。這些光譜區(qū)域 的光譜法參數(shù)的判別式分析能夠以大于90%的靈敏度和特異性對來自健康對象或來自AD 患者的血漿樣品進(jìn)行分類。
[0014] 一方面，本發(fā)明涉及確定血液樣品中與阿爾茨海默氏癥的全面認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)的振動光譜法，包括下列步驟：
[0015] a)記錄事先獲得的人血液樣品的拉曼光譜；
[0016] b)獲得下列拉曼光譜區(qū)域中至少一個的拉曼光譜數(shù)值：
[0017] R. 1. 1600和1700CHT1之間包括的區(qū)域；
[0018] R. 2. 910和980CHT1之間包括的區(qū)域；
[0019] R. 3. 730和760CHT1之間包括的區(qū)域；
[0020] R. 4. 390和450CHT1之間包括的區(qū)域；
[0021] 其中所述光譜數(shù)值選自帶間拉曼強(qiáng)度比值、所述光譜區(qū)域面積值和/或頻率值；
[0022] c)通過比較在步驟b獲得的拉曼光譜值與允許在第I或II類之間進(jìn)行區(qū)分的參 考光譜值，或通過多變量分析比較在步驟b獲得的拉曼光譜值與第I類和第II類參考拉曼 光譜值，將血液樣品分類至下列類別中的一種：
[0023] I.包含與阿爾茨海默氏癥的非認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0024] II.包含與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品。
[0025] 另一方面，本發(fā)明涉及確定血液樣品中與阿爾茨海默氏癥的全面認(rèn)知惡化相關(guān)的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的振動光譜法，包括下列步驟：
[0026] a)記錄事先獲得的人血液樣品的紅外光譜；
[0027] b)獲得下列紅外光譜區(qū)域中至少一個的紅外光譜值：
[0028] IR. 1. 1600和1700CHT1之間包括的區(qū)域；
[0029] IR. 2. 1000和1150CHT1之間包括的區(qū)域；
[0030] IR. 3. 1140和1190CHT1之間包括的區(qū)域；
[0031] 其中所述紅外光譜值選自所述光譜區(qū)域面積值、所述光譜區(qū)域強(qiáng)度比和/或所述 光譜區(qū)域帶間面積百分比值；
[0032] c)通過比較在步驟b獲得的紅外光譜值與允許在第I或II類之間進(jìn)行區(qū)分的參 考紅外值，或通過多變量分析比較在步驟b獲得的紅外值與第I或II類參考紅外光譜值， 將血液樣品分類至下列類別中的一種：
[0033] I.包含與阿爾茨海默氏癥的非認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0034] II.包含與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品。
[0035]
[0036] 另一方面，本發(fā)明涉及鑒定容易接受適于治療阿爾茨海默氏癥的療法的對象的方 法，包括通過振動光譜法確定血液樣品中與阿爾茨海默氏癥的全面認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)，該振動光譜法包括
[0037] 1)下列步驟：
[0038] a)記錄事先獲得的人血液樣品的拉曼光譜；
[0039] b)獲得下列拉曼光譜區(qū)域中至少一個的拉曼光譜值：
[0040] R. 1. 1600和1700CHT1之間包括的區(qū)域；
[0041] R. 2. 910和980CHT1之間包括的區(qū)域；
[0042] R. 3. 730和760CHT1之間包括的區(qū)域；
[0043] R. 4. 390和450CHT1之間包括的區(qū)域；
[0044] 其中所述光譜值選自帶間拉曼強(qiáng)度比值、所述光譜區(qū)域面積值和/或頻率值；
[0045] c)通過比較在步驟b獲得的拉曼光譜值與允許在第I或II類之間進(jìn)行區(qū)分的參 考光譜值，或通過多變量分析比較在步驟b獲得的拉曼光譜值與第I類和第II類參考拉曼 光譜值，將血液樣品分類至下列類別中的一種：
[0046]I.包含與阿爾茨海默氏癥的非認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0047] II.包含與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0048] 和 / 或
[0049] 2)下列步驟：
[0050] a)記錄事先獲得的人血液樣品的紅外光譜；
[0051] b)獲得下列紅外光譜區(qū)域中至少一個的紅外光譜值：
[0052] IR. 1. 1600和1700CHT1之間包括的區(qū)域；
[0053] IR. 2. 1000和1150CHT1之間包括的區(qū)域；
[0054] IR. 3. 1140和1190CHT1之間包括的區(qū)域；
[0055] 其中所述紅外光譜值選自所述光譜區(qū)域面積值、所述光譜區(qū)域強(qiáng)度比和/或所述 光譜區(qū)域帶間面積百分比值；
[0056] c)通過比較在步驟e獲得的紅外光譜值與允許在第I或II類之間進(jìn)行區(qū)分的參 考紅外值，或通過多變量分析比較獲得的紅外值，將血液樣品分類至下列類別中的一種：
[0057] I.包含與阿爾茨海默氏癥的非認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0058] II.包含與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品；
[0059] 其中如果包含該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的血液樣品與阿爾茨海默氏癥的認(rèn)知惡化相關(guān)，則指 示所述對象容易接受適于治療阿爾茨海默氏癥的療法。
[0060] 另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法用于獲得血液樣品中存在或不存在阿爾茨海 默氏癥情況的指示的應(yīng)用。
[0061] 另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷對象的阿爾茨海默氏癥的診斷方法，包括下列步 驟：
[0062] a)測量來自所述對象的血漿樣品的拉曼光譜，獲得至少一個拉曼帶，該拉曼帶選 自包括e-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性振動的拉曼帶、包括肽鍵角變形的特異性振動的淀粉狀肽 的拉曼帶、包括a-螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性振動的拉曼帶和包括具有色氨酸殘基的三級 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性振動的拉曼帶，和
[0063]b)比較在步驟a)獲得的拉曼光譜與參考樣品的光譜，
[0064] 其中指示相對于參考光譜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性強(qiáng)度增加的拉曼光譜變動、 指示相對于參考光譜肽鍵角變形特異性強(qiáng)度增加的拉曼光譜變動、指示相對于參考光譜a_螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特異性強(qiáng)度降低的拉曼光譜變動和/或相對于參考光譜三級蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)中色氨酸殘基的特異性振動產(chǎn)生的拉曼光譜變動，指示患者患有阿爾茨海默氏癥。
[0065] 另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷對象的阿爾茨海默氏癥的診斷方法，包括下列步 驟：
[0066] a)測量來自所述對象的血漿樣品的IR光譜，獲得至少一個存在0 _蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 特異性帶和/或至少一個指示存在氧化應(yīng)激期間生成的化合物的特異性帶，和 [0067]b)比較在步驟（a)獲得的IR光譜與參考樣品的光譜，
[0068] 其中指示相對于參考光譜0 _蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)增加的IR光譜變動和/或指示相對于 參考光譜在氧化應(yīng)激期間樣品中生成的化合物濃度增加的IR光譜變動，指示患者患有阿 爾茨海默氏癥。
[0069] 另一方面，本發(fā)明涉及用于血漿樣品分析的設(shè)備，包括：
[0070] (i)用于接收血漿樣品的容器，
[0071] (ii)至少一個光譜儀，選自拉曼光譜儀和IR光譜儀，
[0072] (iii)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的診斷方法的工具。
[0073] 另一方面，本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)程序，包括適于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的診斷方法的代碼。
[0074] 另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序的數(shù)據(jù)載體。
[0075] 附圖簡述
[0076] 圖1顯示獲自健康對照（a)以及患有輕度（b)、中度（c)和重度（d)AD的患者的外 周血血漿的3600-300CHT1區(qū)域中的拉曼光譜。
[0077] 圖2顯示獲自健康對照（一）以及患有輕度（)和中度（......）AD的患 者的外周血血漿的1720-1600CHT1區(qū)域中的拉曼光譜。
[0078] 圖3顯不獲自健康對照（一）以及患有輕度（---）和中度（......）AD的患 者的外周血血漿的450-380CHT1區(qū)域中的拉曼光譜。
[0079] 圖4顯示獲自健康對照（一）以及患有輕度（一)、中度（......）和重度 .)AD的患者的外周血血漿的1000-900CHT1區(qū)域中的拉曼光譜。
[0080] 圖5顯示獲自健康對照（一）以及患有輕度（---)、中度（......）和重度 (-? - ? - ? )AD的患者的外周血血漿的780-720CHT1區(qū)域中的拉曼光譜。
[0081] 圖6顯示來自老年對照（一）的血漿和來自中度（-----)AD患者的血漿的紅外光 譜。（A):酰胺I區(qū)域。原始光譜（上）和以二階導(dǎo)數(shù)表示的光譜（下）。⑶JlSO-lOOOcnT1 之間的區(qū)域。
[0082] 發(fā)明詳述
[0083] 用于確宙與阿爾茨海默氏癥的全而認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法和用于診 斷阿爾茨海默氏癥的方法
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的方法，通過拉曼光譜法的分析應(yīng)用，在獲得用于確定AD的全面惡化 的方法和診斷AD的方法過程中的問題已被解決，拉曼光譜法提供與二級和三級蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)有關(guān)的光譜參數(shù)，其結(jié)合紅外光譜法技術(shù)進(jìn)一步提供與氧化應(yīng)激有關(guān)的另外的信息，如 本發(fā)明的實(shí)施例3至6所示。
[0085] 本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：獲自AD患者的血漿中的0折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)激 多于獲自健康對照的血漿，而AD患者的a-螺旋結(jié)構(gòu)含量相對于健康對照較低。此外， 這種疾病的全面衰退量表（GlobalDeteriorationScale，⑶S)與下列之間存在一定 相關(guān)性dTOO-ieOOcnT1 (酰胺I)之間和1150-lOOOcnT1之間的紅外光譜譜線，以及酰胺 1(1700-160001^)區(qū)域、980和910CHT1之間包括的區(qū)域（包括獨(dú)特的a-螺旋C-C伸縮 帶）、具有色氨酸殘基的三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的760-730CHT1區(qū)域、角變形的450-390CHT1區(qū)域、 和3100和2800CHT1之間包括的C-H伸縮區(qū)域的拉曼光譜譜線。
[0086] 如前所述，拉曼光譜法提供關(guān)于二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和關(guān)于包含色氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、胱氨酸/半胱氨酸的側(cè)鏈的三級結(jié)構(gòu)的分析-結(jié)構(gòu)信息。有助于在來自健康對象和阿 爾茨海默氏癥患者的血漿樣品之間進(jìn)行區(qū)分的因素，如本發(fā)明所示，不僅是酰胺I帶，而且 是由具有色氨酸和其他的側(cè)鏈的三級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的帶一一其處于500CHT1以下，是可檢測的 拉曼光譜，但通過紅外光譜法不可視。事實(shí)上，本發(fā)明的其中一個優(yōu)勢由首次檢測到的、用 于樣品分類的、可歸屬于淀粉狀0肽的、500-400CHT1區(qū)域中的新參數(shù)或光譜法標(biāo)記組成。 另一方面，紅外光譜法還提供關(guān)于酰胺I區(qū)域中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和關(guān)于1150-lOOOcnT1之間的 區(qū)域中與AD相關(guān)的氧化應(yīng)激的信息。
[0087] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，全面認(rèn)知惡化量表（在本文中也被稱為⑶S)涉及Reisberg 規(guī)定的詳細(xì)描述阿爾茨海默氏癥進(jìn)展階段的全面衰退量表。所述量表由七個水平組成，并 且在本發(fā)明的范圍內(nèi)其被定義為：
[0088] -GDS-1 :相應(yīng)于無認(rèn)知下降的正常個體和正常臨床階段；
[0089] -GDS-2 :相應(yīng)于具有極輕度認(rèn)知下降水平（主觀認(rèn)知惡化）的個體和健忘臨床階 段；
[0090] -GDS-3 :相應(yīng)于具有輕度認(rèn)知下降水平的個體和早期混亂臨床階段；
[0091] -GDS-4 :相應(yīng)于具有中度認(rèn)知下降水平的個體和晚期混亂臨床階段；
[0092] -GDS-5 :相應(yīng)于具有中等重度認(rèn)知下降水平的個體和早期癡呆臨床階段；
[0093] -GDS-6 :相應(yīng)于具有重度認(rèn)知下降水平的個體和輕度癡呆臨床階段；
[0094] -GDS-7 :相應(yīng)于具有極重度認(rèn)知下降水平的個體和重度癡呆臨床階段。
[0095] 基于這種規(guī)定，⑶S-3階段被認(rèn)為是輕度阿爾茨海默氏癥（輕度AD)發(fā)展水平， ⑶S-4和⑶S-5階段被認(rèn)為是中度阿爾茨海默氏癥（中度AD)發(fā)展水平，并且⑶S-6和GDS-7階段被認(rèn)為是晚期的、嚴(yán)重的或重度的阿爾茨海默氏癥（重度AD)發(fā)展水平。
[0096] 本發(fā)明的第一方面涉及通過振動光譜法確定血液樣品中與阿爾茨海默氏癥的全 面認(rèn)知惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法（本發(fā)明的第一方法），包括下列步驟：
[0097]a)記錄事先獲得的人血液樣品的拉曼光譜；
[0098] b)獲得下列拉曼光譜區(qū)域中至少一個的拉曼光譜值：
[0099] R.1. 1600和1700CHT1之間包括的區(qū)域；
[0100] R. 2.910和980CHT1之間包括的區(qū)域；
[0101] R. 3. 730和760CHT1之間包括的區(qū)域；
[0102] R. 4. 390和450CHT1之間包括的區(qū)域；
[0103] 其中所述光譜值選自帶間拉曼強(qiáng)度比值、所述光譜區(qū)域面積值和/或頻率值；