一種冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及冬蟲夏草的鑒定，尤其涉及一種冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 《中國藥典》（2010年版）規(guī)定冬蟲夏草正品為"麥角菌科真菌冬蟲夏草菌 (Cordyceps sinensis炬erk.)Sacc.)寄生在騙幅蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復 合體"。其具有補腎益肺、止血化姨之功效，與人參、鹿茸并稱為中國H大補藥。冬蟲夏草生 長環(huán)境特殊、資源稀少，價格昂貴，市場上出現(xiàn)大量慘偽品、混淆品，如何快速、有效地鑒別 真?zhèn)?，是保證冬蟲夏草臨床用藥安全有效需解決的首要問題。冬蟲夏草偽品主要包括；（1) W它種蟲草加工后冒充：自然界還分布有大量的其它蟲草均為蟲草屬真菌寄生在各種昆蟲 體上形成的子座與蟲體的復合體。據(jù)報道，全世界目前已發(fā)現(xiàn)蟲草400多種，我國現(xiàn)已報道 蟲草約120種，如古尼蟲草、分枝蟲草、涼山蟲草、珊瑚蟲草等。該些"假冒蟲草"W古尼蟲 草充偽最為多見。（2)增重；插入竹簽、金屬絲，附著泥±，注入、涂抹金屬液增重，鹽水浸泡 增重等。（3)壓模"蟲草主要是用淀粉、面粉、石膏粉等加入粘合劑，用冬蟲夏草模子精也 壓制染色而成。部分壓模"蟲草"做得十分精細逼真，外行難W辨識。除此之外，生長于不 同地區(qū)的冬蟲夏草其價格也差別較大，受市場宣傳和傳統(tǒng)觀念影響，W及藏區(qū)雪域高原所 賦予的神秘色彩，普遍認為"藏蟲草"品質最佳，推崇青海、西藏產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)蟲草，市場價格高 于"川蟲草"。在我國，冬蟲夏草主要分布于青海、西藏、四川、甘肅、云南等省，其中四川、西 藏、青海H省占絕大部分。
[0003] 冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定現(xiàn)狀；現(xiàn)行《中國藥典》（2010年版）對冬蟲夏草的鑒別僅規(guī) 定了來源、性狀特征、含量測定等檢查項，含量測定W腺巧為指標成分，要求含腺巧不得少 于0.010%，現(xiàn)行標準已遠不能滿足現(xiàn)今市場商品的發(fā)展變化。其含量測定項指標成分一 腺巧專屬性不強，多種蟲草腺巧含量大于正品冬蟲夏草，對該成分的含量測定難W反映樣 品的真?zhèn)魏推焚|優(yōu)良度。目前國內(nèi)外冬蟲夏草化學成分的研究只局限于少數(shù)種類蟲草與冬 蟲夏草的對比及差異分析，對于鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別作用不大。冬蟲夏草中腺巧等核 巧類物質的含量W往多采用薄層紫外分光光度或高效液相色譜法測定。李紹平等采用毛細 管電泳法來測定天然和人工冬蟲夏草中腺巧、尿巧、鳥巧等3種核巧類成分的含量，并對其 變化進行了考察。結果證明：天然和人工冬蟲夏草中的核巧含量明顯高于天然冬蟲夏草，人 工冬蟲夏草中腺巧的含量差異顯著，高低相差達6倍。而新鮮采集的天然冬蟲夏草（如在 青海玉樹、涅中和云南采集的樣品）中腺巧等的含量極低甚至無法定量，而采集日久者核 巧類成分含量卻較高。而人工冬蟲夏草中腺巧、鳥巧和尿巧的含量卻無明顯變化。證明天 然冬蟲夏草在儲存過程中會產(chǎn)生核巧類成分，且天然和人工冬蟲夏草中核巧類成分有一定 的差異。腺巧作為冬蟲夏草的質量控制指標，不能客觀反映天然冬蟲夏草的質量。因此，腺 巧在質量控制中的應用尚值得進一步研究。
[0004] 冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別一直是無法攻破的技術難題，首先冬蟲夏草的主要功效成分 蟲草素、蟲草多糖、核巧類物質及冬蟲夏草的微量元素，各類學者莫衷一是。其次，冬蟲夏草 的鑒別方法最行之有效的方式是長期W來沿用至今的傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別。導致市場上各種偽蟲 草的出現(xiàn)，有增重、用竹簽W次充好，還有的用相似蟲草代替冬蟲夏草的，更是讓人無法鑒 別。
[0005] 因此，如何實現(xiàn)冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定是本領域技術人員亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及 其制備方法。
[0007] 本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，包括W下步驟：
[000引 S1、冬蟲夏草70kDa糖蛋白提取分離；
[0009] S2、單克隆抗體的制備；
[0010] S3、酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評估；
[0011] S4、試劑盒的組裝。
[0012] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S1包括；通過液相等電聚焦，蛋白電泳，電洗脫儀 等蛋白純化系統(tǒng)制備冬蟲夏草70kDa糖蛋白糖蛋白，W此作為抗原、包被原和試劑盒內(nèi)的 柄準品。
[0013] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S2包括；通過細胞融合技術，抗體純化技術制備 抗冬蟲夏草7〇kDa糖蛋白單克隆抗體。
[0014] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S3包括；建立冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測方法并對其 特異性、抗基質干擾能力和重復性進行評估。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S4包括；將預包被冬蟲夏草70kDa糖蛋白的酶標 板、冬蟲夏草70kDa糖蛋白標準溶液、辣根過氧化物酶標記冬蟲夏草70kDa糖蛋白單克隆抗 體、顯色液和終止液組裝為試劑盒。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，通過如上述任一項所述的冬 蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法制備而成
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：可通過冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測試劑盒實現(xiàn)冬蟲夏草的真?zhèn)?鑒定，抗冬蟲夏草特征蛋白抗體針對的抗原決定簇耐熱，可快速鑒別樣品中的冬蟲夏草真 偽，適用范圍廣，有利于消費者合法權益的保障；特異性好，靈敏度高，抗基質干擾效果好， 檢測結果準確性好，重復性好；樣品的前處理簡單，檢測操作簡單，試劑均W工作液的形式 提供，可方便地進行大量樣本的篩查。
【附圖說明】
[0018] 圖1是冬蟲夏草70kDa糖蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；
[0019] 圖2是冬蟲夏草酶聯(lián)免疫檢測標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合【附圖說明】及【具體實施方式】對本發(fā)明進一步說明。
[0021] 實施例一目標抗原的制備。
[0022] 取冬蟲夏草果草體部分液氮條件碼磨后，取樣品lOg，在冰浴下使用0. IM PBS緩 沖液（9^.4，含0.5%琉基己醇，0.1%1巧661180) 1001111超聲提取1211。離也取上清，使用 60 %飽和度硫酸饋沉淀。8M尿素赴溶沉淀物，離也，對上清液進行透析過夜，得粗分離樣品。
[0023] 初分離的樣品使用垂直電泳儀進行再純化；將初分離的樣品使用4%的濃縮膠和 12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，同時使用預染蛋白標準品作為分子量參照。80v電泳化 后，參照預染蛋白標準品切取分子量為7〇kd的蛋白凝膠條帶。將蛋白凝膠使用研鉢粉碎 后，加入電洗脫儀，使用7M尿素10A電流洗脫她。對收集帽中的富集蛋白進行透析，凍干。 純化的70kDa冬蟲夏草糖蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示，制備的冬蟲夏草70kDa糖 蛋白用于免疫原，包被原和試劑盒標準溶液。
[0024] 實施例二抗冬蟲夏草抗體的制備和純化。
[00巧]用實施例一制備的免疫原分別免疫6周雌性ba化/c鼠，每組3只。首次免疫注射 時，分別100 y g/mL的免疫抗原100 y L與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間 隔兩周后，取用樣的抗原，與100 y L不完全佐劑乳化，同樣方法注射。
[0026] 在細胞融合前Id或當天拉頸處死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，體表消毒；用大頭 針固定昆明鼠在蠟板上，超凈工作臺上剪開腹部，用小綴子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（由6181〇)1??11-1640基礎培養(yǎng)液加入15%胎牛血清而得），用手輕輕揉動腹 腔，將其體內(nèi)液體用無菌吸管移入75血HAT完全培養(yǎng)液（由74. 25血RPMI-1640完全培養(yǎng) 液加入0. 75血100 XHAT液而得）中，用吸管混勻，鋪24孔板，每孔加0. 5血，置于37°C C02 培養(yǎng)箱中。
[0027] 小鼠眼眶放血，收集血清，拉頸處死，70 %酒精浸泡消毒體表，無菌取出脾臟，放入 RPMI-1640基礎培養(yǎng)液（購自GIBIC0,貨號為A10491-01)中，并小也剔除筋膜及脂肪，剪 碎，置于100目的不鎊鋼篩內(nèi)，無菌研磨，釋放出單個脾細胞，吸取含有脾細胞的液體置于 50mL無菌離也管中，離也。
[002引將骨髓瘤細胞和上述制備好的脾細胞W個數(shù)5 ;1的比例加入同一 50血的離也管 中，加入37°C溫浴的RPMI-1640不完全培養(yǎng)液（購自GIBIC0,貨號為61870-036) 20血，混 合均勻，15(K)r/min離也6min，棄去上清，用手指輕擊離也管底部，使沉淀混勻如糊狀；用 移液管取37C預熱的陽G 1血，滴入離也管，靜置Imin后，于37C水浴中在2min內(nèi)滴加 RPMI-1640完全培養(yǎng)液10血，100化/min離也6min，棄去上清，力日75血HAT培養(yǎng)液，輕輕混 勻，將混勻息液分裝于有飼養(yǎng)細胞的24孔板中，每孔0. 5mU于37C、5% C02飽和濕度的培 養(yǎng)箱中賠育。
[0029] 融合后6?9d，用HAT培養(yǎng)液半量換液1次，在12?14d后根據(jù)增殖情況改用 RPMI-1640