專利名稱：免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測二酰基肼化合物的免疫測定方法。
測定二酰基肼化合物的方法是已知的。例如高壓液相色譜(HPLC)，氣液色譜(GLC)，GC-質(zhì)譜分析法，和HPLC-質(zhì)譜分析法是目前存在的少數(shù)幾個(gè)方法。但是，這些方法存在一些缺點(diǎn)。這些方法一般需要昂貴而復(fù)雜的儀器。另外，樣品的制備和分析很長，需要對(duì)這些方法特殊訓(xùn)練過的化學(xué)家和技術(shù)人員。此外，這些現(xiàn)有的技術(shù)方法不能在同一步驟快速篩選類似物或代謝物或兩者。另外，在檢測之前一般需要分離個(gè)別化合物。所以，對(duì)于快速低耗測定如需要在田間測試或大量測試時(shí)這些方法是行不通的。
二酰基肼化合物的特殊作用是作為殺蟲劑，具體是作為加速毛蟲脫皮化合物(MAC)。和所有潛在的有害化學(xué)物質(zhì)一樣，這些殺蟲劑受政府部門的控制。在得到調(diào)控性批準(zhǔn)的過程中，根據(jù)聯(lián)邦殺蟲劑，殺真菌劑和殺鼠劑條例(FIFRA)登記規(guī)則，細(xì)則O要求需要對(duì)殘留物分析，該分析要求對(duì)這些使用具有適當(dāng)靈敏度的測定方法。另外，測定方法必須與二?；職⑾x劑的主要代謝產(chǎn)物有交叉反應(yīng)性以便適用于FIFRA登記規(guī)則，細(xì)則N要求的代謝和環(huán)境影響研究。為了監(jiān)測殺蟲劑的用法可能也需要這些測定。
所以，需要一種二酰基肼測定方法，它具有足夠的靈敏度和交叉反應(yīng)性滿足FIFRA規(guī)則，能快速篩選，使用簡單而廉價(jià)。
本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種免疫化學(xué)測定，它足夠靈敏，具有足夠的交叉反應(yīng)性以滿足FIFRA規(guī)則的要求準(zhǔn)予使用。此外，測定方法使用簡單而廉價(jià)。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一個(gè)免疫原，包括與載體物質(zhì)偶聯(lián)的下列通式的化合物
其中R，R1，R2，R3和R4各自單獨(dú)是，氫，(C1-C6)烷基和取代的(C1-C6)烷基，(C2-C6)鏈烯基和取代的(C2-C6)鏈烯基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)羧基烷基，和鹵原子。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了測定二?；禄蚱溲苌锏姆椒?，包括步驟(A)提供含有未知量的二?；碌臉悠罚?B)在存在固定化二?；驴乖瓡r(shí)把樣品與具有與二?；驴乖Y(jié)合親和力的抗體接觸以便形成結(jié)合的和未結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物；(C)將未結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物與結(jié)合的抗體 抗原復(fù)合物分離；(D)用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記結(jié)合抗體復(fù)合物；(E)使標(biāo)記物發(fā)生可檢測變化；和(F)測定樣品中的二?；?。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了測定二酰基肼或其衍生物的方法，包括步驟(A)提供含有未知量的二酰基肼的樣品；(B)把樣品與具有與二?；驴乖Y(jié)合親和力的固定化抗體接觸以便形成固定化的抗體-抗原復(fù)合物；(C)將具有可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的二酰基肼抗原與未復(fù)合的固定化抗體接觸形成標(biāo)記的抗體-抗原復(fù)合物；(D)使標(biāo)記發(fā)生可檢測變化；和(E)測定樣品中的二?；?。
在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了測定二?；碌脑噭┖?，包括(A)具有與二?；陆Y(jié)合親和力的抗體；(B)能夠與抗體結(jié)合的標(biāo)記；和(C)存在標(biāo)記物時(shí)能產(chǎn)生可檢測變化的底物。
圖(1)描述了DEAE離子交換柱的一個(gè)蛋白質(zhì)洗脫過程。
圖(2)描述了RH2703的抑制曲線。
圖(3)描述了RH2651的抑制曲線。
圖(4)描述了RH5992的抑制曲線。
圖(5)描述了RH0345的抑制曲線。
圖(6)描述了RH2485的抑制曲線。
圖(7)描述了在PBST和基質(zhì)空白樣品中得到的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖(8)描述了甘藍(lán)樣品20139-01的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(9)描述了甘藍(lán)樣品20139-02的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(10)描述了甘藍(lán)樣品20139-04的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(11)描述了甘藍(lán)樣品20139-05的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(12)描述了土壤樣品151的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(13)描述了土壤樣品157的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(14)描述了土壤樣品175的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(15)描述了土壤樣品187的計(jì)算出的線性回歸線。
圖(16)a和b描述了一個(gè)直接測定曲線和直接測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
如本文所用，術(shù)語“抗原”被理解為能刺激抗體產(chǎn)生的任何物質(zhì)。以類似的方式，術(shù)語“二酰基肼抗原”被理解為能刺激抗體產(chǎn)生的任何二?；禄衔?，其中產(chǎn)生的抗體具有與二?；潞推溲苌锏慕Y(jié)合親和力。同時(shí)術(shù)語“免疫原”被理解為包括用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。免疫原一般由載體分子和另一個(gè)組分(半抗原)組成。
如本文所用，術(shù)語“測定”被理解為包括定性分析，即，鑒定樣品中分析物的存在，以及定量分析，即，測定樣品中分析物的量。它也被理解為包括標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備的術(shù)語，這樣的制備是本領(lǐng)域熟知的。
如本文所用，術(shù)語“二酰基肼化合物”被理解為在它的范圍內(nèi)包括二?；录捌浯x物，合成類似物，環(huán)境降解物和由此起源的光化學(xué)降解物。
如本文所用，術(shù)語“IC50”定義為測得的吸光值減少到?jīng)]有抑制劑存在時(shí)的吸光值的到一半所需要的抑制劑的濃度。這一確定是通過繪制剩余活性的百分?jǐn)?shù)(％)相對(duì)抑制劑濃度的曲線完成的，其中剩余活性的百分?jǐn)?shù)(％)由％活性＝(A0-Ai/A0)×100給出，其中A0是沒有抑制劑存在時(shí)測得的吸光值而Ai是抑制劑濃度為ith時(shí)測得的吸光值。從而抑制百分?jǐn)?shù)由關(guān)系式100-(％活性)給出。
交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)由方程式％交叉反應(yīng)性＝(IC50.5992/IC50.類似物)×100得到，其中IC50.5992是如上確定的RH5992的IC50濃度而IC50.類似物是類似物即，RH2703，RH2651和RH0345的IC50濃度。
以ng表示的靈敏度是從重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的回歸分析確定的抑制劑的濃度，如方程S＝(Yint/m)×V所述，其中S是以ng表示的靈敏度，Yint是吸光值單位表示的來自重復(fù)分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差的回歸線的Y-截距，m是每ng/ml吸光值單位的回歸線的斜率而V是加到微滴平板的樣品的體積，單位ml。
回收百分?jǐn)?shù)由關(guān)系式％R＝(C0/Ca)×100計(jì)算，其中C0是觀察(測定)到的濃度而Ca是實(shí)際(最大)濃度。
如上敘述，提供用于制備二?；驴贵w的免疫原，通常，免疫原包括半抗原和載體分子。
半抗原通常是二?；禄蚱溲苌?。在一個(gè)實(shí)施方案中，半抗原是苯甲酰基肼，該苯甲酰基肼化合物是上面通式(1)的化合物。
合適的(C1-C6)烷基的例子包括，但不限于，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正-戊基，異戊基，新戊基，正己基，異己基，等等。合適的(C1-C6)取代烷基的例子包括，但不限于，用羥基，鹵原子，(C1-C4)烷氧基，和硝基取代的甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，新戊基，正己基，等等。
合適的(C2-C6)鏈烯基的例子包括，但不限于，乙烯基，正丙烯基，異丙烯基，正丁烯基，異丁烯基，叔丁烯基，正戊烯基，異戊烯基，新戊烯基，正己烯基，等等。合適的(C2-C6)取代鏈烯基的例子包括，但不限于，用羥基，鹵原子，或硝基基團(tuán)取代的乙烯基，正丙烯基，異丙烯基，正丁烯基，異丁烯基，叔丁烯基，正戊烯基，異戊烯基，新戊烯基，正己烯基，等等。
合適的(C1-C6)烷氧基的例子包括，但不限于，甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基，異丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，異戊氧基，新戊氧基和正己氧基。
合適的(C1-C6)羧烷基的例子包括，但不限于，羧基(-COOH)，羧甲基(-CH2COOH)，羧乙基(-CH2CH2COOH)，和羧丙基(-CH2CH2CH2COOH)。
合適的鹵原子的例子包括，但不限于，Cl-，Br-，F(xiàn)-，和I-。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R是-CH2COOH，R1和R2各為甲基而R3和R4各為氫。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R是-COOH，R1和R2各為甲基而R3和R4各為氫。
載體物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)，例如但不限于，牛血清白蛋白，卵清蛋白，或鑰孔嘁血藍(lán)蛋白；多糖，例如但不限于，葡聚糖，瓊脂糖，瓊脂或纖維素；或合成的聚合物或共聚物，例如但不限于，聚丙烯醛，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚丁酸酯，聚脲，聚脲酰胺，或聚苯乙烯。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體物質(zhì)是載體蛋白質(zhì)，更優(yōu)選的是牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，最優(yōu)選的是鑰孔嘁血藍(lán)蛋白。
本發(fā)明的免疫原可以用于制備抗二?；禄衔锟贵w。把免疫原導(dǎo)入合適的動(dòng)物并收集，分離和純化抗體。得到的抗體是多克隆抗體，與二?；禄衔锖推溲苌铮貏e是苯甲?；潞推溲苌锞哂懈呓Y(jié)合親和力和交叉反應(yīng)性。
另一種可選的方法，利用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的雜交瘤技術(shù)將免疫原用于制備單克隆抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制備了抗與載體物質(zhì)偶聯(lián)的通式(1)的免疫原的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了抗與載體物質(zhì)偶聯(lián)的通式(1)的免疫原的抗體，通式(1)中R是-CH3COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氫。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了抗與載體物質(zhì)偶聯(lián)的通式(1)的免疫原的抗體，其中R是-COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氫。
如上敘述，本發(fā)明提供測定二?；禄蚱溲苌锏姆椒?，首先，該方法包括步驟(A)提供含有未知量的二?；碌臉悠贰?br> 樣品一般是含有二?；碌娜魏挝镔|(zhì)。合適的例子包括空氣，水，土壤，和生物學(xué)物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是空氣樣品或起源于空氣樣品的樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是水樣品或起源于水樣品的樣品。仍然還有另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是土壤樣品或起源于土壤樣品的樣品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是生物學(xué)物質(zhì)或含有生物學(xué)物質(zhì)的樣品或起源于生物學(xué)物質(zhì)的樣品。合適的生物學(xué)物質(zhì)例子包括不限于，植物材料；生物學(xué)液體如血液，血清，血漿，淋巴液，胃灌洗液，膽汁，角膜液；生物組織如植物和動(dòng)物組織，和微生物樣品如細(xì)菌和病毒。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品是土壤或植物材料或起源于此的樣品。
二?；禄衔锶缟厦嫱ㄊ?所述以及其衍生物。這些衍生物可以是，但不限于，代謝物，合成類似物，環(huán)境降解物，起源于此的光化學(xué)降解物，特別有用的二?；率歉鶕?jù)通式1的苯甲?；拢枋鲈谙旅娴谋?中
在固定化二?；驴乖嬖谙?，步驟(B)中步驟(A)的樣品與具有與二?；碌母哂H和力的抗體接觸。
抗體如上所述，從含有與KLH偶聯(lián)的RH2651的免疫原得到的抗體是優(yōu)選的。
固定的二酰基肼抗原可以是與上述任何載體分子偶聯(lián)的上述任何二?；?。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固定抗原是與載體蛋白偶聯(lián)的RH2651或RH2703，更優(yōu)選的是與BSA偶聯(lián)的RH2703。抗原和載體分子的結(jié)合稱為包被抗原。
包被抗原一般固定于具有順從地附著這一抗原的表面的固體支持物上。合適的例子包括，但不限于微滴平板；膜材料如硝酸纖維，纖維素，醋酸纖維素，聚碳酸酯，等等；試管；顆粒如小珠，柱填充材料，等等；和具有能結(jié)合附著其上的抗原的結(jié)合區(qū)的衍生表面。一般包被抗原應(yīng)用于固體支持物并吸附在其上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包被抗原吸附在微滴平板上。
在步驟(B)中，游離抗原(即，樣品中未知量的苯甲?；?和固定的(即，結(jié)合的)抗原之間存在對(duì)具有與二?；赂哂H和力的抗體上的結(jié)合位點(diǎn)的競爭。結(jié)果是形成結(jié)合和未結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物。在步驟(C)中，結(jié)合復(fù)合物與未結(jié)合復(fù)合物分離。分離可以是本領(lǐng)域已知的任何方法，如不限于重力分離，磁分離，以及清洗除去未結(jié)合的復(fù)合物。
一旦與未結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物分離，步驟(D)中用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記結(jié)合的復(fù)合物。標(biāo)記可以是固定于結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物并可檢測的任何物質(zhì)。標(biāo)記物可以直接檢測或通過與底物反應(yīng)間接檢測。合適的例子包括，但不限于酶，顏色染料，熒光材料，化學(xué)發(fā)光材料，生物發(fā)光材料，和放射性同位素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可檢測的標(biāo)記是酶。通常，酶與具有與結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合親和力的物質(zhì)偶聯(lián)。標(biāo)記物與復(fù)合物的結(jié)合可以是抗體-抗原，蛋白質(zhì)-配體，或抗生物素蛋白(鏈霉抗生物素蛋白)-生物素的結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合是抗體-抗原結(jié)合，其中標(biāo)記結(jié)合于具有結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合親和力的抗體。這樣的結(jié)合導(dǎo)致本領(lǐng)域熟知的典型“夾層”構(gòu)型。與標(biāo)記結(jié)合的抗體可以是多克隆或單克隆。另外，可以使用含有抗體結(jié)合區(qū)的任何上述抗體的抗體片段如Fab片段。當(dāng)然，與標(biāo)記物偶聯(lián)的特殊抗體將依賴于與抗原偶聯(lián)的抗體的類型。那就是，所選擇的與標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體與固定抗體-抗原復(fù)合物有結(jié)合親和力。
例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中，在兔中產(chǎn)生與抗原偶聯(lián)的抗體。因此，與標(biāo)記偶聯(lián)的抗體是與兔抗體有結(jié)合親和力的抗-兔抗體。
一旦標(biāo)記了固定化抗體-抗原復(fù)合物后，在步驟(E)中在標(biāo)記物上產(chǎn)生可測定的變化。這一可測定的變化可以由紫外可見光、熒光、電波輻射產(chǎn)生，或?qū)肱c標(biāo)記物反應(yīng)的底物產(chǎn)生可測定的變化?？衫斫獾氖?，可測定變化可以是標(biāo)記固有的，例如，標(biāo)記可以是放射性同位素，其中放射性，如γ射線，可以簡單地通過導(dǎo)入手段產(chǎn)生以便測定放射性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中可測定變化是通過將標(biāo)記的復(fù)合物與底物接觸實(shí)現(xiàn)的。這樣的底物是本領(lǐng)域熟知的并依賴于所用的標(biāo)記類型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物是酶而底物是能夠與酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定變化的化合物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是磷酸酶而底物是磷酸化合物。酶和底物的相互作用一般產(chǎn)生具有可測定特性的化合物。例如化合物是熒光的，具有強(qiáng)吸光值，等等。
最后，在步驟(E)產(chǎn)生可測定變化后，在步驟(F)測定二酰基肼。這樣的測定方法是本領(lǐng)域已知的方法，例如，紫外可見分光光度計(jì)，熒光光度測定法，γ計(jì)數(shù)，等等。
一般認(rèn)為上面敘述的測定方法是間接測定。同時(shí)，應(yīng)理解包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有直接測定。首先，直接方法包括在步驟(A)提供含有未知量的二?；碌臉悠?。樣品和二?；氯缟纤觥?br> 步驟(A)的樣品在步驟(B)中與具有與二?；碌慕Y(jié)合親和力的固定化抗體接觸形成固定化的抗體-二?；聫?fù)合物?？贵w如上所述，RH2651產(chǎn)生的抗體是優(yōu)選的。
抗體一般固定于具有順從地附著這一抗體的表面的固體支持物上。合適的例子包括，但不限于微滴平板；膜材料如硝酸纖維，纖維素，醋酸纖維素，聚碳酸酯，等等；試管；顆粒如小珠，柱填充材料，等等；和具有能結(jié)合附著其上的抗體的結(jié)合區(qū)的衍生表面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上關(guān)于包被抗原的描述，抗體是固定于固體支持物上的包被抗體。
步驟(B)中，游離抗原(即，樣品中未知量的苯甲?；?填充了固定化多克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)形成固定化抗體-抗原復(fù)合物。步驟(C)中用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的二?；驴乖c未與樣品中苯甲?；陆Y(jié)合的固定化抗體的位點(diǎn)接觸。從而，標(biāo)記抗原將填充抗體的剩余結(jié)合位點(diǎn)。以致固定化抗體與標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原偶聯(lián)。二?；驴乖蜆?biāo)記如上所述。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原是RH2651而標(biāo)記物是酶，優(yōu)選的是辣根過氧化物酶(HRP)。
最后，在步驟(D)中在標(biāo)記物上實(shí)現(xiàn)可測定變化并在步驟(E)中測定二?；隆？蓽y定變化的產(chǎn)生和二?；碌臏y定如上對(duì)間接測定所述。
本文所述的對(duì)二?；氯鏡H5992和它的衍生物RH2703，RH2651，RH0345和RH2485的測定足夠靈敏可用于FIFRA登記要求的田間殘留物研究。此外，該測定方法有足夠的與結(jié)構(gòu)不同的類似物如RH0345的交叉反應(yīng)性，因此確信該測定將適用于取代的N-叔丁基-N，N’-苯甲?；職⑾x劑的全部類型。
除了測定的靈敏度(ppb)和它通用于RH5992代表的殺蟲劑類型以外，最大的優(yōu)點(diǎn)可能是增高的實(shí)驗(yàn)室效率。例如，已經(jīng)證明一個(gè)分析員每天能容易地完成20個(gè)樣品。這一估價(jià)包括樣品制備和結(jié)果計(jì)算。假如1天工作10小時(shí)，每個(gè)樣品只需消耗30分鐘的勞動(dòng)。
本發(fā)明抗體的其它用途包括將抗體與固體支持物結(jié)合以便濃縮樣品基質(zhì)中的殘留物，所以可以用熒光標(biāo)記標(biāo)記它們并用于組織研究以鑒定殺蟲劑殘留物在細(xì)胞腔隙的位置。這一信息提供了關(guān)于特殊二?；禄衔锏亩拘院痛x的作用方式或機(jī)制的重要信息。同時(shí)，直接免疫測定方法可以結(jié)合進(jìn)田間分析的“浸枝”試驗(yàn)和檢查應(yīng)用的類型。
下面的縮寫被用于下面的實(shí)施例中以及本說明書的其它部分。BCA Bicin choninic 酸BSA 牛血清白蛋白DCC 二環(huán)己基碳化二亞胺DEA 二乙醇胺DMF 二甲基甲酰胺HRP 辣根過氧化物酶KLH 鑰孔嘁血藍(lán)蛋白NHS N-羥基琥珀酰亞胺PBS 磷酸緩沖鹽水PBST PBS和0.01％吐溫20PNPP 對(duì)硝基苯磷酸實(shí)施例1免疫原合成在5ml梨型燒瓶中加入21umole半抗原RH2651，并溶解于200ulDMF(Fisher Scientific)。在另一4ml試管中將16mgDCC(EM Sciences)和9.1mgNHS(Sigma Chemical)溶解于200ulDMF。將DCC和NHS轉(zhuǎn)移到含有半抗原的燒瓶中，反應(yīng)物在室溫下攪拌約2小時(shí)。轉(zhuǎn)移反應(yīng)物到冷室，繼續(xù)在4℃攪拌過夜。
在5.4ml去離子水中重新配制載體蛋白，KLH(ImjectR，PierceChemical Co.重新配制時(shí)將20mg蛋白質(zhì)(pH7.2)溶于PBS)。轉(zhuǎn)移活化的半抗原至小離心器(235B型小離心器，F(xiàn)isher Scientific)離心5分鐘除去取代脲沉淀。轉(zhuǎn)移上清液到重新配制的載體蛋白溶液并在室溫連續(xù)攪拌4小時(shí)。
以14000rpm將蛋白質(zhì)反應(yīng)混合物離心5分鐘除去沉淀蛋白。將全部體積的上清液加到SwiftR聚丙烯酰胺去鹽柱(Pierce Chemical Co.)上并用0.01M PBS(pH7.3)洗脫，以3ml一部分收集。在樣品完全加到柱上后收集這些流份。取10個(gè)3ml流份并測量280nm處每流份的吸光值。合并含有免疫原的流份并用BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度(參見BCA蛋白質(zhì)測定試劑說明-Pierce Chemical Co.)。
半抗原/蛋白質(zhì)結(jié)合比例確定如下。建立了254nm處0ug/ml-1200ug/ml范圍的KLH的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將BCA方法測得的免疫原流份的蛋白質(zhì)濃度轉(zhuǎn)變成254nm的吸光值。建立了濃度范圍26260nmole/ml的RH2703和濃度范圍為6.5-210nmole的RH2651在254nm處的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定254nm處免疫原的吸光值(Aconj)，減去計(jì)算得的254nm處KLH的吸光值(AKLH)得到半抗原產(chǎn)生的吸光值(AHap)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)變?cè)撝?AHap)成為半抗原的濃度(nmole/ml)。
從半抗原的計(jì)算濃度(nmole/ml)除于免疫原的測定濃度計(jì)算半抗原對(duì)蛋白質(zhì)的摩爾結(jié)合比例。使用的KLH平均分子量為6.7×106道爾頓。將摩爾結(jié)合比例除于670得到每10,000原子質(zhì)量單位的KLH中半抗原分子的平均數(shù)。結(jié)果列于表2中。
實(shí)施例2其它免疫原的合成按照實(shí)施例1的方法制備免疫原，但所用的半抗原是RH2703。結(jié)果表示在表2中。
實(shí)施例3包被抗原合成按照實(shí)施例1制備免疫原的方法制備包被抗原(RH2703和RH2651)，不同的是BSA(ImjectR，Pierce Chemical Co.)代替KLH作為載體蛋白。用于計(jì)算摩爾結(jié)合比例的BSA平均分子量是68,000道爾頓。將摩爾結(jié)合比例除于6.8得到每10,000amu BSA的半抗原分子平均數(shù)。制備的包被抗原的結(jié)果表示在表2中。
表2
(1)N是每10,000原子質(zhì)量單位的蛋白質(zhì)的半抗原分子數(shù)。
實(shí)施例4抗體的生產(chǎn)從2.5ml免疫原(在0.01M PBS中重新配制為1mg/ml的實(shí)施例2的產(chǎn)物)，25mg結(jié)核分支桿菌懸浮液和2.5ml弗氏佐劑制備初級(jí)接種物。將混合物勻漿化直到粘稠和奶油色。
利用新西蘭白兔(5)生產(chǎn)抗體。兔子是重量在4.75-5.5磅之間的無疾病的雌性。首先將抗百日咳桿菌(制備成0.6ml鹽水中懸浮6×1010細(xì)胞的百日咳桿菌接種物)肌肉內(nèi)接種兔子并采血提供背景效價(jià)。
每個(gè)兔子皮下注射的初級(jí)接種物的劑量是1.0ml。接種兔子并每21天接受加強(qiáng)的免疫接種。在第四次加強(qiáng)注射8天后，給兔子放血收集抗體。在另一個(gè)時(shí)間周期后，再開始加強(qiáng)注射并在第四次加強(qiáng)注射后再做生產(chǎn)放血。
實(shí)施例5測定兔抗血清在包被緩沖液(PBS，pH7.2)中將包被抗原重新配制為起始濃度約10ug/ml。將96孔微滴平板的第1和2列的孔保留用于對(duì)照樣品。首先在第3列的孔中加入200ul起始濃度的包被抗原。第4-12列的孔含有100ul包被緩沖液。轉(zhuǎn)移第3列的孔中的100ul包被抗原部分到第4列的孔中與包被緩沖液混合，以這種方式，在每個(gè)隨后獲得的列的孔中用包被緩沖液以1∶2系列稀釋包被抗原。稀釋過程繼續(xù)到第11列，其中包被抗原進(jìn)行了1∶256的稀釋。丟棄最后的100ul。只含有包被緩沖液沒有抗原的第12列的孔作為陰性對(duì)照?？譇1和A2是空氣空白，不接受試劑?？譈1和B2用包被抗原包被并且是背景孔?？證1和C2被100ul包被緩沖液中的KLH(約10ug/ml)包被作為陽性對(duì)照。其余的孔D1-H2是未處理的。用封口條封住這樣制備的平板，用塑料包被覆蓋包裹，放置于冰箱中，在4℃溫育過夜。
過夜溫育后，從冰箱中取出平板并倒空。用300ul BSA封閉液(1％BSA，pH7.2由在100mlPBS中溶解1.0g BSA制備)封閉孔(除了A1和A2)中的未結(jié)合結(jié)合位點(diǎn)。該溶液至少在室溫下溫育10分鐘。
用封閉液1∶1000稀釋測試樣品，在A排中從A3孔開始將200ul加到孔中。B3-H3排的孔含有100ul封閉液。轉(zhuǎn)移A排孔的測試樣品(100ul)到B排孔并完全混合。以這種方式1∶2連續(xù)稀釋樣品到G3排的孔(1∶64000)并丟棄最后100ul。H3排的孔不含有抗體是陰性對(duì)照。用100ul封閉液1∶500稀釋的預(yù)血清溫育背景孔B1和B2。用測試樣品的1∶1000稀釋液溫育陽性對(duì)照孔C1和C2。用測試樣品溫育平板約1小時(shí)。
溫育后，除去測試樣品并用洗液洗孔。用緩沖液沖洗孔4-5次。在第三或第四次洗滌時(shí)。允許緩沖液保留在孔中，在丟棄前浸泡3-5分鐘。用1ml 50％的甘油重新配制與堿性磷酸酶(Pierce Chemical Co.)連接的山羊抗兔IgG并用封閉液稀釋1∶5000。在每個(gè)孔中加入100ul該溶液并在室溫溫育平板至少1小時(shí)。洗去過量的抗兔抗體，在每個(gè)孔中加入100ulPNPP溶液(5mgPNPP溶解于8ml去離子水和2ml DEA緩沖液)。在室溫溫育平板30分鐘。然后加入50ul 2N NaOH終止酶反應(yīng)。用DynatechMR5000微滴平板讀數(shù)器測定410nm處每個(gè)孔的吸光值。結(jié)果表示在表3中。
表3
1沒有測定抗體效價(jià)。2該動(dòng)物的耳疤痕阻止了獲取測試血。
實(shí)施例6分離和純化抗體合并實(shí)施例3的注射過程中收集的免疫血清并用BCA方法測定總蛋白，發(fā)現(xiàn)是66mg/ml。測定免疫血清的體積并分成兩個(gè)各90ml的相同的等分試樣。一個(gè)等分試樣用兩倍體積的去離子水稀釋。用等體積的4M硫酸胺依次稀釋得到的溶液體積最后得到2M硫酸胺溶液。在室溫?cái)嚢钁腋∫哼^夜。通過在10000g-av.離心30分鐘收集蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)沉淀溶解于最小體積的0.02M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)，該緩沖液是通過稀釋0.1M磷酸鈉緩沖液制備的。
在2L 0.02M磷酸鈉緩沖液(pH8)中，在室溫透析重新配制的蛋白質(zhì)溶液4小時(shí)，然后在4L中，在4℃透析過夜，最后在4L中，在室溫下透析4小時(shí)。
利用DEAE纖維素(DE52，Whatman，Inc.)用兩個(gè)獨(dú)立的等分試樣從合并的抗血清離子交換純化IgG，該纖維素濕體積為150ml，在2.6cm(i.d.)的柱中填充了約26cm高的床。用0.02M的磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡柱。柱的蛋白質(zhì)容量約為1.5g(每ml濕體積10mg)。將全部體積的透析蛋白溶液泵到柱上，用0.02M的磷酸鈉緩沖液pH8.0開始洗脫。調(diào)整流速到約5ml/分鐘，每5ml收集流份。開始的150ml洗脫液含有任何未保留的蛋白質(zhì)。
在開始的150ml后，線性梯度摩爾濃度連續(xù)變化到0.3M。梯度是在兩個(gè)梯度形成室形成的，第一個(gè)室含有250ml 0.02M緩沖液，第二個(gè)室含有250ml 0.3M緩沖液。洗脫過程中連續(xù)攪拌第一個(gè)室，以5ml一管的流份收集接下來的500ml洗脫液。通過測定280nm的吸光值檢測蛋白質(zhì)洗脫液，將吸光值對(duì)洗脫體積(收集管號(hào)#)繪圖得到層析譜。
通過本文敘述的間接方法測定每一管的等分試樣的IgG。合并含有IgG的部分，用具有Amicon濾紙(分子量排斥極限-10,000道爾頓)的攪拌細(xì)胞濃縮器減少體積。用標(biāo)準(zhǔn)的BCA方法測定合并的濃縮的IgG流份的蛋白質(zhì)濃度。在蛋白質(zhì)溶液中加入無菌過濾和-20℃儲(chǔ)存的疊氮化鈉。來自DEAE離子交換柱的蛋白質(zhì)洗脫曲線描述在

圖1。開環(huán)代表從280nm處的吸光值測得的總蛋白。閉環(huán)代表410nm處間接測定測得的每流份的抗體效價(jià)。合并部分流份號(hào)51-80，用蛋白質(zhì)親和層析進(jìn)一步純化。
用蛋白質(zhì)A親和Pak柱和免疫純RIgG緩沖液(免疫純IgG純化試劑盒，Pierce Chemical Co.)親和純化DEAE純化的IgG(1mg/ml)。放置蛋白質(zhì)A柱和緩沖液至室溫，用5ml結(jié)合緩沖液洗柱。1∶9稀釋DEAE純化IgG得到蛋白質(zhì)濃度6mg/ml，將1ml等分試樣加至柱上。用另外15ml結(jié)合緩沖液洗柱。
用5ml免疫純IgG洗脫緩沖液進(jìn)行IgG的洗脫，獲取1ml流份。測定280nm處每部分的吸光值，用預(yù)先用10ml 0.02M PBS(20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH7.4)調(diào)節(jié)過的5ml前纖維素柱對(duì)具有顯著吸光值的流份(流份3)去鹽。利用10個(gè)1ml的0.02M PBS等分洗脫，收集1ml一流份。用BCA方法測定每個(gè)流份總蛋白的吸光值。
1∶5稀釋蛋白質(zhì)A親和層析純化的IgG得到蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。從66mg/ml的平均總血清蛋白質(zhì)得到估計(jì)的9mg/ml IgG濃度，估計(jì)的IgG回收率是67％。
實(shí)施例7間接測定的最佳化利用RH2703-BSA作為包被抗原。在存在恒量蛋白質(zhì)A純化IgG(10ul 20ug/ml溶液，100ng/孔)時(shí)，通過方格型測定(參見Voller等人，Bull of World Health Organization，53，35(1976))使存在最小量的抗原(RH2703)時(shí)得到可讀反應(yīng)(0.3-0.5吸光值單位410nm)需要的濃度最佳化。在存在恒量包被抗原(RH2703-BSA，100ul 10ug/ml溶液)時(shí)獲得對(duì)最小量的RH5992的可讀反應(yīng)使蛋白質(zhì)A純化IgG的濃度最佳化。
抗體濃度最佳約為20ug/ml(100ng/微孔)而包被抗原最佳為25ng/ml或2.5ng/微孔。當(dāng)轉(zhuǎn)換成摩爾基礎(chǔ)并假設(shè)半抗原/蛋白質(zhì)結(jié)合比例為55，半抗原摩爾數(shù)超過加入的IgG三倍。
確定了存在最佳濃度的RH2703-BSA包被抗原時(shí)RH2703，RH2651，RH5992，RH0345和RH2485對(duì)蛋白質(zhì)IgG的抑制百分?jǐn)?shù)。在從沒有測試物質(zhì)0ng/ml到1000ng/ml范圍的7個(gè)濃度測試每個(gè)測試物質(zhì)。每個(gè)濃度的測試重復(fù)7次。抗原陰性和抗體陰性孔提供陰性對(duì)照而KLH/抗KLH孔用作陽性對(duì)照。
用含有0.1％吐溫20的包被緩沖液作測試物質(zhì)儲(chǔ)存液的系列稀釋得到1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml測試濃度。包被緩沖液w/0.1％吐溫20用作0ng/ml測試濃度。在室溫用10ul蛋白質(zhì)A IgG(20ul/ml)溫育測試濃度的測試物質(zhì)(每個(gè)190ul)1小時(shí)。在溫育周期后，轉(zhuǎn)移100ul測試物質(zhì)-IgG混合物到適當(dāng)?shù)奈⒌慰住Ｎ⒌慰滓呀?jīng)用最佳濃度的RH2703-BSA包被并用0.3ml的包被緩沖液中的1％BSA溶液封閉過量的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在室溫再溫育平板1小時(shí)。
在第二次溫育后，洗滌平板，加入與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-兔免疫球蛋白(用1ml 50％甘油重構(gòu)0.6mg，隨后用封閉液稀釋1∶5000-Pierce Chemical Co.)。如實(shí)施例5所述溫育，洗滌平板，加入PNPP底物。不加入NaOH終止液，在讀410nm處吸光值之前允許平板顯色2小時(shí)。抑制曲線描述在圖2-6。特殊的純化抗體特征數(shù)據(jù)表示在表4中。
如上所述確定IC50。用Microsoft ExcelAnalysis ToolPak(微軟公司，版權(quán)1993)設(shè)定的指數(shù)曲線分析活性百分?jǐn)?shù)對(duì)抑制劑濃度的關(guān)系。為了計(jì)算IC50，當(dāng)y等于50，即保留50％活性或50％抑制時(shí)，由指數(shù)方程y＝bmnx得到x。用Microsoft Excelc，Ver5.0制圖法(微軟公司，版權(quán)1993)進(jìn)行制圖。
如上所述從IC50計(jì)算交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)。用Microsoft Excel，Ver5.0制圖法(微軟公司，版權(quán)1993)制得從7個(gè)抑制劑濃度得到的7次重復(fù)分析的平均吸光值的圖。將線性動(dòng)力學(xué)范圍顯示在從各種抑制劑濃度在410nm處的吸光值的圖得到的曲線的線性部分。如上所述計(jì)算靈敏度。
定義檢測的極限為三倍的測定背景噪音，為了估計(jì)背景噪音，計(jì)算了每個(gè)抑制劑濃度的重復(fù)分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行回歸分析的最少平方法。將回歸線的y-截距當(dāng)作噪音產(chǎn)生的背景吸收。以3乘背景吸收，用線性范圍得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相除，轉(zhuǎn)換成抑制劑濃度。定義這樣得到的濃度為抑制劑的測定極限。
表4
實(shí)施例8-19間接測定用100ul/孔的RH2703-BSA包被抗原(10ug/ml)包被微滴平板得到每孔包被量1ug。在4℃溫育平板過夜。在使用前用300ul/孔的1％的包被緩沖液中的BSA溶液封閉未結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
取約1g甘藍(lán)和土壤樣品的等分試樣。將甘藍(lán)樣品#03(1.0191g)和土壤樣品#49(1.0180g)作為對(duì)照并用50ng或500ng的RH5992示蹤以便測定回收率。樣品和所用的樣品量示于下面表6中。
將樣品等分試樣置于25ml圓錐型離心管并用50或500ng的RH5992示蹤回收樣品，該RH5992是用PBST稀釋RH5992儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)液(乙腈中1mg/ml)制備的。
通過用聲波細(xì)胞破碎器(SonicatorHeat Systems，Inc.W-225R型，帶有H-1微端探針)在80％功率聲波處理3分鐘，用5ml PBST等分試樣萃取樣品。以4000g離心萃取混合物5分鐘，輕輕倒出PBST層。用PBST稀釋每種樣品的等分試樣得到原始樣品提取物的1∶100稀釋液(甘藍(lán)樣品)和1∶500稀釋液(土壤樣品)。
將稀釋樣品的等分試樣(180ul)與10ul每種RH5992標(biāo)準(zhǔn)液(2，10，20，100，200和2000ng/ml)和IgG(10ul)混合得到具有RH5992最后濃度分別為0.1，0.5，1，5，10，和100ng/ml的樣品。樣品在12×8排列的96孔形式的硼硅酸酯玻璃管中完全混合。對(duì)應(yīng)于抗體陰性孔的管含有10ul緩沖液。對(duì)應(yīng)于抗原陰性孔的管沒有IgG加入并含有100ppb的PBST中的RH5992。對(duì)應(yīng)于KLH陽性對(duì)照的管空著。
在1小時(shí)的溫育周期后，轉(zhuǎn)移100ul示蹤樣品到微滴平板并繼續(xù)溫育1小時(shí)。
溫育后，如上所述洗滌平板并加入100ul與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG并在室溫溫育1小時(shí)，溫育后，再洗滌平板，加入100ul PNPP底物。繼續(xù)用底物溫育1-2小時(shí)并用Dynatech MR5000微板讀數(shù)器測定410nm處的吸光值。計(jì)算抗原陰性孔測得的吸光值的平均值并自動(dòng)將它從測試孔中除去，以這種方式除去抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的吸光值。
用標(biāo)準(zhǔn)加法定量樣品中的殘留水平。用Microsoft Excel，Ver5.0制圖法從減去了非特異結(jié)合的重復(fù)樣品吸光值的平均倒數(shù)得到吸光值倒數(shù)相對(duì)加入的抑制劑濃度的圖。用Microsoft ExcelAnalysis ToolPak將得到的數(shù)據(jù)代入方程式y(tǒng)＝mx+b。在這個(gè)關(guān)系式中，y是實(shí)驗(yàn)測得的吸光值倒數(shù)，b是常數(shù)，m是計(jì)算的斜率而x是加入的抑制劑的濃度。計(jì)算每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相對(duì)于來自線性方程的有關(guān)計(jì)算值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，最后除去無關(guān)的值。
當(dāng)y等于不加抑制劑測得的吸光值倒數(shù)時(shí)解對(duì)于X的線性方程，得到樣品濃度。乘以對(duì)應(yīng)的稀釋因子將結(jié)果轉(zhuǎn)換成總ng數(shù)。用取的樣品質(zhì)量除于總ng數(shù)得到最后結(jié)果ng/g。
用外部標(biāo)準(zhǔn)方法建立定量樣品殘留物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Microsoft ExcelAnalysis ToolPak進(jìn)行指數(shù)曲線設(shè)定和線性回歸分析。如上所述計(jì)算回收百分?jǐn)?shù)。
用外部標(biāo)準(zhǔn)法和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法(加法)分析峰值為50ng/g和500ng/g的回收樣品?；厥瞻俜?jǐn)?shù)的結(jié)果表示在表5中的圓括號(hào)中。在PBST和基質(zhì)空白樣品(甘藍(lán)樣品#03和土壤樣品#49)中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖表示在圖7中。
表5
來自甘藍(lán)和土壤樣品的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)分析的結(jié)果表示在表6中。一星期后再分析兩個(gè)甘藍(lán)和土壤提取物估計(jì)樣品基質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果表示在圓括號(hào)中。每個(gè)樣品的計(jì)算線性回歸線表示在圖8-15。
表6
實(shí)施例20標(biāo)記抗原的合成將4.6mg(10.5umole)量的RH2651置于5ml的梨型燒瓶并溶解于100ml DMF。在另外的試管中，將4.6mg NHS和8.8ul DCC各溶解于100ulDMF。將NHS和DCC加入RH2651并在室溫?cái)嚢杓s一小時(shí)。在4℃繼續(xù)攪拌過夜。接著將10mg HRP溶解于2.7ml 0.01M PBS，pH7.2。在Beckman小離心機(jī)E(Beckman儀器)離心RH2651/NHS/DCC三次。將上清液逐滴加入HRP并攪拌。在室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)，然后在小離心機(jī)中離心3分鐘。用PBS平衡過的Swift去鹽柱(Pierce Chemical Co.)對(duì)含有偶聯(lián)蛋白質(zhì)的上清液去鹽。用PBS洗脫蛋白質(zhì)并以3ml/份收集流份。合并280nm的吸光值確定的含有蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的流份并用BCA蛋白質(zhì)測定法(PierceChemical Co.)確定蛋白質(zhì)濃度。
如下證明RH2651與HRP的結(jié)合。用100ul的10ug/ml 2651-HRP包被微板孔并在4℃儲(chǔ)存過夜。倒空平板后，用1％的PBS中的BSA封閉孔。封閉后，在孔中加入按照實(shí)施例6制備的蛋白質(zhì)A純化的2651IgG的1∶2連續(xù)稀釋液(以1∶500開始)以便探測RH2651。在1小時(shí)室溫溫育后，用0.01％吐溫20 PBS洗平板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG并在室溫再溫育1小時(shí)。洗平板并加入對(duì)-硝基苯磷酸底物。15分鐘顯色期后，用Dynatech MR5000微板讀數(shù)器測定410nm處的吸光值。
對(duì)RH2651與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的評(píng)估證實(shí)了1∶32000的2651IgG抗1ug 2651-HRP的效價(jià)。這表明了偶聯(lián)反應(yīng)成功。
實(shí)施例21包被抗體最佳化用2651IgG包被微板。從第1列開始在每個(gè)孔中加入100ul 10ug/ml2651IgG并在平板上作1∶2的系列稀釋。密封平板并儲(chǔ)存于4℃直到準(zhǔn)備使用。倒空后，用0.01％溶于PBS中的吐溫20洗平板并在室溫用1％的溶于PBS中的BSA封閉1小時(shí)。封閉后，倒空平板并在每個(gè)孔中加入150ulPBS。然后沿平板從10ug/ml開始加入50ul 2651-HRP稀釋液并繼續(xù)沿平板1∶2稀釋。在1小時(shí)室溫溫育后，象前面一樣洗滌平板并在每個(gè)孔中加入150ul 1-StepSlow-TMB(來自Pierce Chemical Co.的過氧化物酶底物)。在1小時(shí)顯色后，加入150ul 1N H2SO4終止反應(yīng)，用DynatechMR5000微板讀數(shù)器測定每個(gè)孔在450nm處的吸光值。對(duì)照包括沒有包被抗原的孔和沒有2651-HRP加入的孔。確定包被抗體2651IgG濃度為0.625ug/ml和2561-HRP濃度為1.25ug/ml對(duì)于使用1-StepSlow-TMB底物是最適濃度。
實(shí)施例22直接測定各用100ul 0.625ug/ml2651IgG包被微板的孔。留下一排不包被作對(duì)照。在4℃保留平板過夜。第二天用0.01％的溶于PBS中的吐溫20洗平板并用1％的溶于PBS中的BSA封閉至少30分鐘。從1mg/ml的儲(chǔ)存液制備RH5992，RH2651，RH2703，和RH2485的標(biāo)準(zhǔn)液。將RH0345的標(biāo)準(zhǔn)液制備成0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，和100ng/ml。在倒空封閉液后，在適當(dāng)?shù)目字屑尤?50ul標(biāo)準(zhǔn)液。加入150ulPBS作零對(duì)照。在室溫溫育45分鐘后，在每個(gè)孔中加入50ul 1.25ug/ml2651-HRP并晃動(dòng)平板混合內(nèi)容物。一個(gè)含有抗體和標(biāo)準(zhǔn)液的列不接受2651-HRP而是50ul PBS作為陰性對(duì)照。在室溫溫育45分鐘后，象前面一樣洗平板并在每個(gè)孔中加入150ul 2651-HRP，晃動(dòng)平板混合內(nèi)容物。一個(gè)含有抗體和標(biāo)準(zhǔn)液的列不接受2651-HRP而是50ul PBS作為陰性對(duì)照。在室溫溫育45分鐘后，象前面洗平板并在每個(gè)孔中加入150ul Step 1SlowTMB。在室溫下2小時(shí)后，在每個(gè)孔中加入150ul 1N H2SO4，用DynatechMR5000微板讀數(shù)器讀出450nm處的吸光值。
圖16a顯示了測定實(shí)驗(yàn)的典型曲線?？梢娗€的線性部分在0.01ng/ml和10ng/ml之間。圖16b利用吸光值倒數(shù)產(chǎn)生一個(gè)正斜率顯示了測定的線性范圍的典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于RH5992的計(jì)算的檢測極限為0.096ng/ml而計(jì)算的靈敏度為0.005ng。表7給出了RH5992和類似物的數(shù)據(jù)。
表權(quán)利要求
1.一種免疫原，包括與載體物質(zhì)偶聯(lián)的下列通式的化合物
其中R，R1，R2，R3，和R4是各自獨(dú)立的氫，(C1-C6)烷基和取代的(C1-C6)烷基，(C2-C6)鏈烯基和取代的(C2-C6)鏈烯基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)羧烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原，其中載體物質(zhì)選自包括蛋白質(zhì)，多糖，合成聚合物或共聚物的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原，其中R是-COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原，其中R是-CH2COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氫。
5.權(quán)利要求1的免疫原產(chǎn)生的抗體。
6.權(quán)利要求3的免疫原產(chǎn)生的抗體。
7.權(quán)利要求4的免疫原產(chǎn)生的抗體。
8.測定二酰基肼或其衍生物的方法，包括步驟(A)提供含有未知量的二?；碌臉悠罚?B)存在固定化的二?；驴乖瓡r(shí)將樣品與具有與二?；驴乖慕Y(jié)合親和力的抗體接觸以致形成結(jié)合和未結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物；(C)分離結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物和未結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物；(D)用可檢測標(biāo)記標(biāo)記結(jié)合抗體復(fù)合物；(E)在標(biāo)記上產(chǎn)生可測定的變化；和(F)測定樣品中的二酰基肼。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中可檢測標(biāo)記選自酶，顏色染料，熒光物質(zhì)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)，和放射性同位素。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中可測定標(biāo)記是能結(jié)合抗體的酶-抗體偶聯(lián)物。
11.測定二?；禄蚱溲苌锏姆椒?，包括步驟(A)提供含有未知量的二酰基肼的樣品；(B)將樣品與具有與二酰基肼抗原結(jié)合親和力的固定化抗體接觸以便形成固定化的抗體-抗原復(fù)合物；(C)將用可測定標(biāo)記物標(biāo)記的二?；驴乖c未復(fù)合的固定抗體接觸形成標(biāo)記的抗體-抗原復(fù)合物；(D)在標(biāo)記上產(chǎn)生可測定的變化；和(E)測定樣品中的二?；?。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中可測定標(biāo)記選自酶，顏色染料，熒光物質(zhì)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)，和放射性同位素。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的所述方法，其中標(biāo)記是能結(jié)合抗體的酶-抗原偶聯(lián)物。
14.測定二?；碌脑噭┖校?A)具有與二?；陆Y(jié)合的親和力的抗體；(B)能結(jié)合于抗體的標(biāo)記物；和(C)存在標(biāo)記物時(shí)能產(chǎn)生可測定變化的底物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有二酰基肼抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中標(biāo)記物是具有與抗體結(jié)合的親和力的與一種抗體偶聯(lián)的酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中標(biāo)記物是與具有與抗體結(jié)合親和力的與二酰基肼抗原偶聯(lián)的酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了免疫原、抗體、試劑盒和利用它們測定二?；禄衔锏姆椒āＴ摲椒ㄈ菀资褂?、廉價(jià)、提供了適當(dāng)?shù)慕徊娣磻?yīng)性和靈敏度以便能在FIFRA規(guī)則下使用。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1189618SQ9711927
公開日1998年8月5日 申請(qǐng)日期1997年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月12日
發(fā)明者J·D·薩克, E·S·卡塞爾, S·S·斯大維司基, 吳曙光 申請(qǐng)人:羅姆和哈斯公司