本發(fā)明涉及具有代謝重編程功能的deptor作為生物標(biāo)志物在胰腺癌診斷中的應(yīng)用，屬于腫瘤醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、胰腺癌是一種高度侵襲性惡性實(shí)體腫瘤，患者的5年生存率僅為10％。預(yù)計(jì)到2040年之前，胰腺癌將超過結(jié)直腸癌，成為僅次于肺癌的癌癥相關(guān)死亡的主要原因。驅(qū)動(dòng)胰腺癌高致死率的因素有很多，其中最主要的原因是該病的早期癥狀十分隱匿且缺乏早期腫瘤診斷的生物標(biāo)志物，此外由于胰腺特殊的解剖位置進(jìn)而無法進(jìn)行常規(guī)的診室篩查，導(dǎo)致90％的胰腺癌患者在初次診斷時(shí)已達(dá)疾病進(jìn)展期，其中半數(shù)以上患者出現(xiàn)全身轉(zhuǎn)移。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找重要的腫瘤標(biāo)志物、有效的治療靶點(diǎn)、緩解化療抵抗的解決方案對(duì)實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早診斷、早治療、延緩復(fù)發(fā)以及改善預(yù)后具有至關(guān)重要的作用。

2、目前腫瘤診斷的方法分為5級(jí)：①臨床診斷：根據(jù)臨床癥狀、體征以及影像學(xué)檢查，參考疾病發(fā)展規(guī)律做出的推測(cè)診斷；②手術(shù)診斷：經(jīng)手術(shù)或各種內(nèi)鏡檢查，僅以肉眼看到的腫物而做出的判斷，未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；③理化診斷：在臨床上符合癌癥表現(xiàn)，并有理化檢查陽性結(jié)果支持，如x線、b超、ct和mri核磁共振檢查，或癌胚抗原、甲胎蛋白測(cè)定等；④細(xì)胞病理學(xué)診斷：根據(jù)各種脫落細(xì)胞、穿刺細(xì)胞檢查而做出的診斷；⑤組織病理學(xué)診斷：經(jīng)粗針穿刺后獲得的組織，制成病理切片，進(jìn)行病理分析后得到的診斷。在這5級(jí)中，其診斷的可靠性依次增加，以第五級(jí)最為理想。但上述方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)和早診斷，更多的是在腫瘤發(fā)展到一定程度后，甚至患者出現(xiàn)嚴(yán)重的病狀體征，此時(shí)往往會(huì)錯(cuò)失最佳治療時(shí)期，使后期治療處于極大的被動(dòng)狀態(tài)，并且診斷效果較好的病理學(xué)診斷需要穿刺取細(xì)胞或組織切片，對(duì)患者的精神和身體存在較大損害和消極影響。找到更加有效的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早期診斷，至關(guān)重要。

3、代謝重編程是腫瘤發(fā)生發(fā)展的特征性標(biāo)志之一，不僅在腫瘤的發(fā)生初期就顯現(xiàn)出來，而且在腫瘤的發(fā)展過程中持續(xù)演變。區(qū)別于正常細(xì)胞，癌癥細(xì)胞高度依賴于谷氨酰胺代謝，“谷氨酰胺成癮”為腫瘤細(xì)胞提供維持增值存活、應(yīng)對(duì)放化療、缺氧或饑餓等應(yīng)激條件所需的大量能量支持。腫瘤代謝異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且可以作為腫瘤早期診斷的重要標(biāo)志。因此，以特定的方式量化腫瘤代謝異常水平對(duì)實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早診斷、早治療具有十分重要的臨床意義。并且全面系統(tǒng)的了解腫瘤代謝的機(jī)理，才能更好的靶向腫瘤代謝生物標(biāo)志物，突破目前我們?cè)谀[瘤診斷方面研究的瓶頸，實(shí)現(xiàn)通過代謝異常這個(gè)角度對(duì)胰腺癌早期診斷的完善。

4、鑒于上述背景，為了更準(zhǔn)確地掌握腫瘤代謝異常情況、實(shí)現(xiàn)胰腺癥的盡早診斷、盡早治療，有必要尋找到與胰腺腫瘤代謝異常發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵標(biāo)志物，并將其用于胰腺癌的早期診斷和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題或首要目的是，應(yīng)用新的腫瘤標(biāo)志物評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平，并基于此對(duì)受試者進(jìn)行胰腺癌的早期診斷。

2、本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供用于評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的產(chǎn)品。

3、本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供用于胰腺癌早期診斷的產(chǎn)品。

4、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

5、第一方面，本發(fā)明將deptor作為生物標(biāo)志物，應(yīng)用于制備評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的試劑。

6、進(jìn)一步地，本發(fā)明還將deptor作為生物標(biāo)志物，應(yīng)用于制備胰腺癌早期診斷試劑。

7、本發(fā)明的方案中，deptor(dep-domain?containing?mtor-interacting?protein)是一種具有代謝重編程功能的蛋白質(zhì)，其ncbi序列號(hào)為：np_001269941.1。

8、本發(fā)明所述的方案中，通過使用針對(duì)deptor的免疫檢測(cè)試劑檢測(cè)來自受試者的樣本中deptor的表達(dá)水平，即可有效地對(duì)受試者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平進(jìn)行評(píng)估；進(jìn)一步地，基于所述個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的評(píng)估結(jié)果，實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷。所述的來自受試者的樣本是受試者的靜脈外周血、癌旁組織或腫瘤組織中的任意一種。

9、本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的試劑是基于elisa或western?blot方法的免疫檢測(cè)試劑。

10、第二方面，本發(fā)明還提供一種抗體，所述的抗體是能夠特異性結(jié)合所述deptor的抗體。

11、第三方面，本發(fā)明還提供一種可定量或半定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒，內(nèi)含本發(fā)明第二方面所述的抗體。

12、本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的可定量或半定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒是可通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)方法或免疫印跡(westernblot)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒；所述的試劑盒內(nèi)有第一抗體和第二抗體；所述的第一抗體是本發(fā)明第二方面所述的抗體，所述的第二抗體為與所述第一抗體同源的酶標(biāo)記抗體。

13、第四方明，本發(fā)明還提供特異性結(jié)合所述deptor的抗體在制備評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的試劑盒或胰腺癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方案中，所述的試劑盒內(nèi)還有選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說明書、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑。

15、其中，使用說明書記載了如何采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、如何利用檢測(cè)結(jié)果評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平、以及如何根據(jù)患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平評(píng)估結(jié)果對(duì)胰腺癌發(fā)展進(jìn)行判斷。

16、本發(fā)明致力于解決胰腺癌早期診斷領(lǐng)域的技術(shù)挑戰(zhàn)，提供了一種新的特定生物標(biāo)志物deptor，并將其用于評(píng)估患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平、以及胰腺癌的早期診斷。通過檢測(cè)該生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)患者個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的評(píng)估和胰腺癌的早期診斷。這一生物標(biāo)志物從腫瘤代謝異常的層面為胰腺癌的早期診斷提供了有力工具，能夠更有效地對(duì)受試者患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行早期初步評(píng)估和預(yù)測(cè)。這種技術(shù)的應(yīng)用將有助于胰腺癌患者獲得盡早診斷和盡早治療。本發(fā)明基于所述生物標(biāo)志物制備的檢測(cè)試劑盒可以適用于個(gè)體化谷氨酰胺代謝水平的評(píng)估和胰腺癌的早期診斷。

17、本發(fā)明所述的deptor與胰腺癌腫瘤細(xì)胞代謝異常高度相關(guān)。具體來講，我們通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，mtor天然抑制分子deptor與谷氨酰胺分解代謝的激活有關(guān)。沉默deptor可以促使谷氨酰胺脫氫酶(gdh)活性抑制分子sirt4的降解。分子機(jī)制上，deptor通過其pdz結(jié)構(gòu)域直接與sirt4結(jié)合，這種結(jié)合抑制了sirt4通過泛素化途徑進(jìn)行降解。因此沉默deptor破壞了sirt4的穩(wěn)定性，抑制了sirt4的表達(dá)，從而促進(jìn)了gdh酶活性，激活了谷氨酰胺分解代謝過程中谷氨酸向α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化這一關(guān)鍵的代謝節(jié)點(diǎn)。在臨床樣本中，我們發(fā)現(xiàn)deptor的表達(dá)水平與谷氨酰胺水平呈顯著負(fù)相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)揭示了胰腺癌細(xì)胞通過沉默deptor來抑制sirt4表達(dá)從而促進(jìn)谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了deptor蛋白在靶向癌癥診斷和治療中的潛力。

18、上述發(fā)現(xiàn)具體是通過以下研究得到的：

19、1材料和方法

20、1.1使用材料：

21、(1)細(xì)胞種類：panc1細(xì)胞系和sw1990細(xì)胞系來自atcc

22、(2)病人樣本：樣本組織從浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院獲得。對(duì)人胰腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織進(jìn)行ihc染色，比較腫瘤和正常組織樣本的蛋白表達(dá)情況。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度對(duì)組織切片染色進(jìn)行定量評(píng)分。

23、(3)基因敲降所用sirna序列如下：

24、sideptor:5’-gccatgacaatcggaaatcta-3’

25、1.2試驗(yàn)方法

26、(1)蛋白質(zhì)的水平檢測(cè)：首先在細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，然后用相應(yīng)的抗體與蛋白質(zhì)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)并通過底物顯色確定特異性目的蛋白的表達(dá)與作用情況。用于本發(fā)明的蛋白水平的檢測(cè)系統(tǒng)包括：免疫沉淀、免疫印跡測(cè)定。所用抗體為deptor(cst,#11816)。

27、谷氨酰胺代謝檢測(cè)：細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清谷氨酰胺含量、細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量、細(xì)胞內(nèi)α-kg水平、谷氨酰胺酶活性、谷氨酰胺脫氫酶活性以及谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性均采用商業(yè)化的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，確保細(xì)胞在檢測(cè)前的良好狀態(tài)，并嚴(yán)格按照各試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

28、2結(jié)果與分析

29、2.1deptor的蛋白水平在人胰腺癌組織中顯著下調(diào)且與預(yù)后不良相關(guān)

30、通過對(duì)臨床病例的ihc染色結(jié)果提示deptor在腫瘤組織中的蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(結(jié)果如圖1所示，其中，左側(cè)為胰腺癌患者術(shù)后的癌(tumor)與癌旁(adjacent)的組織芯片經(jīng)過deptor的特異性抗體免疫組化染色在不同放大倍數(shù)下顯示的deptor表達(dá)結(jié)果，右側(cè)為對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。生存分析同樣提示deptor低表達(dá)的胰腺癌患者的總生存率較deptor高表達(dá)的患者顯著降低(結(jié)果如圖2所示，其中下方藍(lán)色的曲線代表deptor低表達(dá)的胰腺癌患者數(shù)據(jù)，上方紅色的曲線代表deptor高表達(dá)的患者數(shù)據(jù))。為了探索deptor在胰腺癌疾病進(jìn)展過程中蛋白水平的改變情況，我們進(jìn)一步分析了不同病理分期中deptor的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著患者病理分期的增加，deptor的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，這表明在胰腺癌進(jìn)展過程中deptor的表達(dá)水平被顯著抑制(結(jié)果如圖3所示，其中，左側(cè)為不同病理分級(jí)(g1、g2和g3)的胰腺癌患者術(shù)后的癌與癌旁組織芯片經(jīng)過deptor的特異性抗體免疫組化染色后，在不同放大倍數(shù)下顯示的deptor表達(dá)結(jié)果，右側(cè)為對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。單因素和多因素分析表明deptor的表達(dá)水平可以獨(dú)立于其他臨床指標(biāo)，作為胰腺癌的獨(dú)立臨床預(yù)后因素，這也表明deptor的表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后具有良好的預(yù)測(cè)效能(deptor表達(dá)水平與多種臨床因素進(jìn)行的單因素和多因素cox分析結(jié)果如圖4所示)。

31、2.2抑制deptor可以通過激活mtor信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增值與存活

32、panc1和sw1990兩種人胰腺癌細(xì)胞株中使用deptor的小干擾rna(sirna)敲低deptor的表達(dá)，通過cck-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了沉默deptor后細(xì)胞的存活和增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，panc1和sw1990細(xì)胞在敲低deptor后表現(xiàn)出細(xì)胞增殖能力的顯著增強(qiáng)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，其中由sictrl藍(lán)色線條代表對(duì)照組，由sideptor紅色線條代表敲低deptor組)。同時(shí)，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)抑制deptor可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的存活能力(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，其中左側(cè)為細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，右側(cè)為對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；每個(gè)圖中由sictrl代表對(duì)照組，由sideptor代表敲低deptor組)。

33、2.3deptor通過影響谷氨酰胺脫氫酶(gdh)活性促進(jìn)胰腺癌谷氨酰胺的分解代謝

34、對(duì)胰腺癌隊(duì)列進(jìn)行g(shù)sva功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)deptor的表達(dá)改變與多種腫瘤代謝相關(guān)信號(hào)通路的改變密切相關(guān)(基于胰腺癌隊(duì)列的全基因組gsva富集分析結(jié)果如圖7所示)，代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，隨著deptor的表達(dá)抑制，許多化合物的含量同樣出現(xiàn)了改變，其中就包括谷氨酰胺和谷氨酸含量出現(xiàn)了顯著下調(diào)(代謝組學(xué)分析結(jié)果如圖8所示)。

35、2.4抑制deptor通過激活gdh酶活性促進(jìn)胰腺癌中谷氨酰胺的分解代謝

36、在沉默deptor后，胰腺癌細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基上清中谷氨酰胺的消耗較未沉默deptor的對(duì)照組顯著增加，且細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平和谷氨酸水平較未沉默deptor的對(duì)照組顯著下降，而細(xì)胞內(nèi)α-kg水平并未發(fā)生顯著改變(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，其中“sicontrol”代表未沉默deptor的對(duì)照組，“sideptor”代表沉默deptor的對(duì)應(yīng)胰腺癌細(xì)胞組)，且在沉默deptor后細(xì)胞內(nèi)gdh的酶活性顯著升高(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，其中，左側(cè)柱圖是panc1細(xì)胞的結(jié)果，右側(cè)柱圖是sw1990細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；每個(gè)柱圖中，“sicontrol”代表未沉默deptor的對(duì)照組，“sideptor”代表沉默deptor的對(duì)應(yīng)胰腺癌細(xì)胞組)

37、2.5抑制deptor通過降解sirt4促進(jìn)gdh的酶活性

38、通過質(zhì)譜分析deptor結(jié)合的蛋白組分，從中檢測(cè)到了幾個(gè)已知的deptor結(jié)合蛋白，如mtor、rictor等。并且我們關(guān)注到了一種新的相互作用蛋白sirt4(分析結(jié)果如圖11所示)。因?yàn)橐延醒芯勘砻鱯irt4是影響gdh酶活性的核心調(diào)控因子，隨后通過wb實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在胰腺癌細(xì)胞系中沉默deptor后，sirt4的蛋白水平較未沉默deptor的對(duì)照組顯著下調(diào)(wb實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，其中，sicontrol和vector代表對(duì)照組、“sideptor”代表沉默deptor的對(duì)應(yīng)胰腺癌細(xì)胞組)。

39、2.6deptor表達(dá)水平與谷氨酰胺水平呈顯著負(fù)相關(guān)

40、通過皮爾僧相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者腫瘤組織中deptor的表達(dá)水平與谷氨酰胺水平呈顯著的負(fù)相關(guān)性(皮爾僧相關(guān)性分析結(jié)果如圖13所示)。

41、經(jīng)過上述各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)了deptor表達(dá)水平低的患者，其經(jīng)典的mtor信號(hào)通路功能被顯著激活，顯著促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而其非經(jīng)典的谷氨酰胺代謝功能被顯著激活。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

43、1、本發(fā)明基于胰腺癌谷氨酰胺代謝的機(jī)理，找到了針對(duì)谷氨酰胺代謝的腫瘤標(biāo)志物，通過檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，并個(gè)體化評(píng)估患者的谷氨酰胺代謝水平。

44、2、樣品采集靜脈外周血即可完成檢測(cè)，極大降低了受試者的心理負(fù)擔(dān)和身體損傷。