本發(fā)明屬于分析化學(xué)，涉及一種同時測定尿中草酸、檸檬酸和胱氨酸的質(zhì)譜檢測方法。

背景技術(shù)：

1、泌尿系結(jié)石是最常見的泌尿疾病之一，在我國發(fā)病率高達6%～10%。研究發(fā)現(xiàn)90%以上的結(jié)石患者存在尿代謝異常，其中尿草酸、尿檸檬酸、尿胱氨酸對于結(jié)石發(fā)生風(fēng)險有主要預(yù)警價值，其代謝異常可導(dǎo)致原發(fā)性高草酸尿癥（罕見?。?、繼發(fā)性高草酸尿癥、低檸檬酸尿癥和胱氨酸尿癥（罕見?。┑?。因此，無論對結(jié)石高風(fēng)險人群還是泌尿系結(jié)石患者來說，做尿液代謝評估都十分必要。不僅可以早期預(yù)警結(jié)石發(fā)生風(fēng)險，還有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)石病因，定期監(jiān)測糾正代謝異常，從而達到預(yù)防結(jié)石的目的。

2、現(xiàn)有技術(shù)中已公開同時檢測尿液中檸檬酸、草酸和胱氨酸的方法，例如cn115389684a公開了一種同時檢測24h尿液中草酸、檸檬酸和胱氨酸的方法，但是其檢測過程中的衍生化步驟需采用苯甲醇、三甲基氯硅烷、四甲基氟化銨和乙腈多種試劑，且衍生化反應(yīng)溫度高達80℃，衍生化反應(yīng)時間需75min。cn117330684b公開了同時檢測尿液中檸檬酸、草酸和胱氨酸的檢測方法及試劑盒，改進了衍生化反應(yīng)的溫度和時間，但整個前處理過程仍然耗時較長。又如cn116381104a公開了一種有機酸的檢測方法及其應(yīng)用，其前處理中雖然未進行衍生化處理，但色譜分離后各物質(zhì)分離度和峰型不佳，受環(huán)境ph影響較大，無法適用于制備試劑盒檢測。

3、因此，如何提供一種樣本前處理方法便捷快速、無需衍生化步驟、檢測準確度高、分離度和峰型較佳的適用于大批量臨床應(yīng)用的檢測方法，成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏度、高特異性、分離度好、便捷快速的同時測定尿液中草酸、檸檬酸和胱氨酸的檢測方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面提供了一種同時測定尿液中草酸、檸檬酸和胱氨酸的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：待測樣品前處理，工作溶液的制備，進樣溶液的制備，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，將檢測值代入標準曲線中，計算獲得待測樣品中草酸、檸檬酸和胱氨酸的含量。

3、進一步，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的條件包括：色譜柱：csh色譜柱；流動相a：0.4%氨水+10?mm乙酸銨；流動相b：乙腈。

4、進一步，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的條件還包括：流速：0.2?ml/min；進樣量：5?μl；柱溫：40℃；初始流動相：97%流動相a。

5、進一步，所述流動相a的配置方法包括400?ml水+800?μl?5m?乙酸銨+1600?μl氨水，現(xiàn)用現(xiàn)配。

6、進一步，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測使用的儀器為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀。

7、進一步，所述待測樣品前處理為離心獲取上清液。

8、進一步，所述待測樣品前處理為取1毫升待測樣品，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，獲取上清液。

9、進一步，所述工作溶液的制備包括：1）標準溶液的制備；2）混標溶液的制備；3）內(nèi)標工作液的制備；4）含內(nèi)標稀釋液的制備；5）標準曲線樣品的制備。

10、1）所述標準溶液的制備包括：草酸內(nèi)標母液：草酸（乙二酸）-13c2用純水配置成終濃度為100ppm；檸檬酸內(nèi)標母液：檸檬酸-d4用純水配置成終濃度為100ppm；胱氨酸內(nèi)標母液：l-胱氨酸-3,3,3',3'-d4用純水配置成終濃度為1000ppm。

11、2）所述混標溶液的制備包括：混a（濃度為200ppm）：草酸內(nèi)標母液、檸檬酸內(nèi)標母液、胱氨酸內(nèi)標母液和流動相a的比例為1:1:1:2。用流動相a稀釋混a，獲得混b~混f，其濃度分別為100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm。

12、進一步，所述混a的制備包括：40?μl草酸內(nèi)標母液+40?μl檸檬酸內(nèi)標母液+40?μl胱氨酸內(nèi)標母液+80?μl流動相a；所述混b（100ppm）的制備包括：20?μl混a+20?μl流動相a；所述混c（50ppm）的制備包括：10?μl混a+30?μl流動相a；所述混d（20ppm）的制備包括：10?μl混a+90?μl流動相a；所述混e（10ppm）的制備包括：10?μl混a+190?μl流動相a；所述混f（5ppm）的制備包括：5?μl混a+195?μl流動相a。

13、3）所述內(nèi)標工作液的制備包括：草酸或檸檬酸內(nèi)標母液用流動相a稀釋10倍，胱氨酸內(nèi)標母液用水稀釋10倍后再用流動相a稀釋10倍，配置成濃度為10ppm的內(nèi)標工作液。

14、4）所述含內(nèi)標稀釋液的制備包括：草酸內(nèi)標工作液、檸檬酸內(nèi)標工作液、胱氨酸內(nèi)標工作液和流動相a的比例為2:2:1:14，混勻獲得含內(nèi)標稀釋液。

15、5）所述標準曲線樣品的制備包括：用含內(nèi)標稀釋液和流動相a、混a~混f的混標溶液混合，比例為19:1，獲得空白、250ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb、10000ppb濃度的標準曲線樣品。

16、進一步，所述空白濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與流動相a比例為19:1；所述250ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混f比例為19:1；所述5000ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混e比例為19:1；所述1000ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混d比例為19:1；所述2000ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混c比例為19:1；所述5000ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混b比例為19:1；所述10000ppb濃度的樣品是指含內(nèi)標稀釋液與混a比例為19:1。

17、進一步，所述進樣溶液的制備為上清液與流動相a以1:1的比例混勻，獲得2倍稀釋的待測樣品；所述2倍稀釋的待測樣品與含內(nèi)標稀釋液以1:19的比例混勻，獲得40倍稀釋的進樣溶液。

18、所述進樣溶液的制備優(yōu)選為吸取100?μl上清液加入100?μl流動相a，吹勻，獲得2倍稀釋的待測樣品；取10?μl?2倍稀釋的待測樣品加入190?μl含內(nèi)標稀釋液，吹勻，獲得40倍稀釋的進樣溶液。

19、進一步，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測為將進樣溶液進行液相色譜分離，將液相色譜分離后的樣品進行質(zhì)譜分析；分析空白、250ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb、10000ppb濃度的標準曲線樣品，根據(jù)檢測值計算出標準曲線；分析進樣溶液，將檢測值代入標準曲線中，計算獲得待測樣品中草酸、檸檬酸和胱氨酸的含量。

20、進一步，所述質(zhì)譜條件為esi離子源，正負離子切換模式。

21、進一步，所述待測樣品來源包括人、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、豬、猴、羊、牛。

22、進一步，所述待測樣品為尿液樣品。

23、進一步，所述待測樣品為24小時的尿液樣品。

24、本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明第一方面所述的檢測方法在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品包括制備用于檢測草酸、檸檬酸和胱氨酸的產(chǎn)品，或，制備用于診斷泌尿結(jié)石的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

25、所述產(chǎn)品包括但不限于試劑盒。

26、本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明采用的方法可將尿液樣本通過一步稀釋法直接上機，免除了復(fù)雜的衍生化等前處理步驟，相比現(xiàn)有的專利方法，將前處理時間從75分鐘以上縮短為1分鐘以內(nèi)，大大提升檢測效率，降低了檢測成本，且具有高靈敏性和高特異性，可以有效促進該方法的臨床應(yīng)用。