本發(fā)明屬于化學發(fā)光檢測，具體涉及一種白介素12p70的化學發(fā)光檢測試劑盒及其制備和應用。

背景技術：

1、化學發(fā)光檢測法是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法，使用化學發(fā)光技術、抗體標記技術制備試劑組分，通過抗原抗體間的特異性免疫反應實現對待測物的定量檢測。目前采用化學發(fā)光檢測對待測物定量檢測時，是將與待測物結構相似的抗原用緩沖液制備成一定濃度值的校準品(液體或固體)，通過測定校準品制作校準曲線，計算待測物濃度。

2、白介素12p70(il-12p70)是一種多生物學活性的細胞因子，其在抗瘤免疫中的重要作用是通過巨噬細胞、nk細胞調節(jié)的自然抵抗力以及通過th1細胞、nk1.1+tcrint細胞、ctl細胞介導的獲得性免疫之間建立聯系的。白介素12p70調節(jié)腫瘤患者的免疫應答是腫瘤治療的一個新的、有前途的策略。因此開發(fā)一種高靈敏度的白介素12p70蛋白檢測方法學，具有非常重要的臨床意義。

3、現有的化學發(fā)光檢測方法檢測白介素12p70靈敏度較低，為了提高靈敏度，通常會使用大量的抗體，但卻提高了成本。因此急需找到一種能高效檢測白介素12p70的方法。

技術實現思路

1、為彌補已有技術的缺陷，本發(fā)明提供了一種白介素12p70的化學發(fā)光檢測試劑盒及其制備和應用，針對其中連接白介素12p70抗體的吖啶酯復合物溶液，采用層析柱搭配核酸蛋白檢測儀去除游離吖啶酯，從而使游離吖啶酯和吖啶酯復合物完全分開，消除游離吖啶酯的干擾，純化效果更好；同時在磁珠上偶聯鏈霉親和素抗體，延展固相載體的表面反應臂，從而消除各個抗體與抗原反應時相互間的干擾，放大信號并減少抗體用量；用于白介素12p70檢測時，能夠降低本底值，提高信噪比，能顯著提高化學發(fā)光檢測白介素12p70的靈敏度和準確性。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種白介素12p70的化學發(fā)光檢測試劑盒的制備方法，所述方法包括以下步驟：

3、1、制備連接第一抗體的磁珠溶液；

4、2、制備連接第二抗體的吖啶酯復合物溶液，經層析柱搭配核酸蛋白檢測儀去除游離吖啶酯；

5、所述第一抗體和第二抗體分別為白介素12p70第一抗體和白介素12p70第二抗體。進一步地，步驟2所述的吖啶酯復合物溶液中包括第一緩沖液，所述第一緩沖液包括nah2po4·2h2o、na2hpo4、nacl。

6、進一步地，所述連接第二抗體的吖啶酯溶液中還包括封閉劑，所述封閉劑中包括賴氨酸。

7、進一步地，步驟2所述層析柱中填料為g25/g50葡聚糖，所述填料需先經第二緩沖液清洗，所述第二緩沖液中包括nah2po4·2h2o、na2hpo4、nacl、proclintm300。

8、在一些方式中，所述連接第二抗體的吖啶酯復合物溶液的制備過程為：在37℃孵育條件下，將第二抗體鏈接吖啶酯，并使用層析柱搭配核酸蛋白檢測儀除去游離的吖啶酯，獲得待測第二抗體鏈接吖啶酯的信號放大體系。

9、由于37℃條件下，第二抗體活性增強，促使第二抗體與吖啶酯結合效率得到提升；通過使用層析柱，能將未與第二抗體結合的吖啶酯(也包括其他雜質)去除，提高了第二抗體與吖啶酯復合物的純度，從而提升信號值，并能去除游離吖啶酯的影響，背景值得到降低。

10、在一些方式中，所述連接第二抗體的吖啶酯復合物溶液的具體制備過程為：

11、(1)將第二抗體與吖啶酯反應，37℃孵育60min；加入3％的賴氨酸反應60min，達到封閉效果；

12、(2)將(1)中所得產物使用層析柱過濾，通過核酸蛋白檢測儀，收集第二抗體與吖啶酯復合物，去除多余的吖啶酯；

13、(3)將(2)的產物制備成工作液，所述工作液包括緩沖液，所述緩沖液由5.23g/lmops、9g/l?nacl、20g/l?bsa、0.3ml/l?proclintm300配置。

14、進一步地，步驟1制備連接第一抗體的磁珠溶液的方法為：

15、(a)將第一抗體溶液與生物素酯混合反應，制備生物素化抗體；

16、(b)磁珠與鏈霉親和素抗體偶聯，再用鏈霉親和素、生物素化抗體進行包被。

17、針對磁珠溶液，本發(fā)明設計了信號放大體系，磁珠先鏈接鏈霉親和素抗體，然后再與鏈霉親和素特異性反應，可將鏈霉親和素鏈接至磁珠上；將第一抗體鏈接生物素，通過生物素與鏈霉親和素間的高親合力，可將第一抗體鏈接至磁珠上。由于生物素與親和素之間放大效應可提升信號值，但因一個親和素可結合四個生物素化抗體，使得固相周圍空間擁擠，反應受到抑制，尤其在檢測大分子物質時，影響更為明顯。本發(fā)明利用磁珠上偶聯鏈霉親和素抗體，延展磁珠的表面反應臂，從而消除各個抗體與抗原反應時相互間的干擾，能夠有效提高試劑靈敏度，減少抗體用量。既提升檢測性能，又降低成本。

18、進一步地，所述信號放大體系的獲取過程為：

19、(1)將第一抗體鏈接生物素，得到生物素化抗體；

20、(2)磁珠上鏈接鏈霉親和素抗體；

21、(3)磁珠上的鏈霉親和素抗體與鏈霉親和素反應，生物素化抗體上的生物素也與鏈霉親和素反應，從而獲得磁珠-鏈霉親和素抗體-鏈霉親和素-生物素-第一抗體的復合體，制得第一抗體鏈接至磁珠上的信號放大體系。

22、進一步地，步驟(a)所述第一抗體溶液需用pbs緩沖液透析。

23、進一步地，步驟(b)所述包被完成后，需用第三緩沖液清洗，所述第三緩沖溶液包括pbs、氯化鈉、牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、明膠、海藻酸鈉、peg?20000、triton?x-100和proclintm300。

24、在一些方式中，所述連接第一抗體的磁珠溶液的制備過程為：

25、(1)將用pbs緩沖液過夜透析后的白介素12p70第一抗體與生物素酯按比例混合反應，反應后，再用pbs緩沖液過夜透析，獲得生物素化抗體；

26、(2)將磁珠清洗活化后，與鏈霉親和素抗體偶聯，封閉，磁珠磁分離；

27、(3)將(2)中磁分離后的磁珠、鏈霉親和素、生物素化抗體進行37℃過夜包被；

28、(4)對包被產物37℃封閉3h，用第三緩沖液清洗，重懸磁珠配制工作液。

29、在一些方式中，所述白介素12p70第一抗體與生物素酯按1mg抗體：(1.33ul～13.3ul)10mmol/l生物素酯的比例混合反應。

30、在一些方式中，所述磁分離后的磁珠、鏈霉親和素、生物素化抗體按照1mg：10ug：40ug的比例進行包被。

31、另一方面，本發(fā)明提供了如上所述方法制備的白介素12p70的化學發(fā)光檢測試劑盒。

32、再一方面，本發(fā)明提供了一種白介素12p70的化學發(fā)光檢測方法，通過將待測樣品、磁珠溶液、吖啶酯復合物溶液一起孵育，形成免疫復合物，清洗，與底物反應產生光信號。

33、再一方面，本發(fā)明提供了一種第二緩沖液用于提高層析柱中游離吖啶酯和吖啶酯復合物分離效果，所述緩沖液中包括nah2po4·2h2o、na2hpo4、nacl、proclintm300。

34、再一方面，本發(fā)明提供了一種封閉劑用于制備提高層析柱中游離吖啶酯和吖啶酯復合物區(qū)分效果的試劑的用途，所述封閉劑包括賴氨酸和bsa。

35、本發(fā)明的有益效果為：

36、1、通過采用層析柱搭配核酸蛋白檢測儀去除游離吖啶酯和雜質，顯著提高連接白介素12p70抗體的吖啶酯復合物的純化效果，從而提升信號值，并能去除游離吖啶酯的影響，背景值得到降低；

37、2、通過優(yōu)化吖啶酯復合物溶液中的封閉劑和緩沖液配方，從而提高層析柱搭配核酸蛋白檢測儀區(qū)分游離吖啶酯和吖啶酯復合物的效果；

38、3、通過生物素與鏈霉親和素間的高親和力，將第一抗體鏈接到磁珠上，既能延展磁珠的表面反應臂，解決空間位阻問題，消除各個抗體與抗原反應時相互間的干擾，又能放大信號；

39、4、將磁珠溶液和純化后的吖啶酯復合物溶液組合，用于化學發(fā)光檢測白介素12p70時，能有效提高檢測靈敏度，減少抗體用量，既提升了檢測性能，又降低成本，使檢測靈敏度達到0.105pg/ml。