本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和梅毒螺旋體(tp)等四種病原體的檢測試劑盒及其應(yīng)用和制備方法等。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和梅毒螺旋體(tp)均為國家規(guī)定的重大傳染性疾病，流行的范圍廣，嚴(yán)重影響人民的身體健康。其中，尤其是hiv，國際醫(yī)學(xué)界至今尚無防治艾滋病的有效疫苗、藥物和療法，自1985年在中國境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)艾滋病病例報告數(shù)以來，我國艾滋病病例報告數(shù)平均以每年30％-40％的速度增加。

除了傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查外，早期對這四種病原體的免疫學(xué)聯(lián)合檢測方法操作較為繁瑣，過程不容易標(biāo)準(zhǔn)化，檢測靈敏度低，尤其是特別容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。所以近年來，對這四種病原體的檢測逐漸傾向于用基于核酸的pcr法來檢測，例如，中國專利申請cn101487062a公開了一種同步檢測肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，其采用一步法單管單酶多項聯(lián)合檢測的taqmanpcr擴增體系；又如，中國專利申請cn102230032a公開了一種病原體核酸的等溫鏈置換多重檢測卡，可以多重檢測hbvdna、hcvrna、hivrna和tpdna，其采用等溫鏈置換來進行多重檢測。

然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于pcr的靈敏度太高，而檢測實驗室難免不受各種檢測樣品的污染，即使進行消毒，也很難完全去除各病原體的病毒核酸片段，因此造成不少假陽性結(jié)果，容易引起糾紛。

近年來，對這四種病原體的免疫學(xué)聯(lián)合檢測方法也有所發(fā)展，但是主要使得過程標(biāo)準(zhǔn)化，然而檢測靈敏度，尤其是結(jié)果準(zhǔn)確性方面，改進不大。例如，中國專利申請cn102023216a公開了一種對乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原體進行共檢的懸浮芯片，可快捷地同時檢測待檢樣品中的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原體，然而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其檢測準(zhǔn)確性還有待進一步提高，尤其是其容易造成hiv檢測假陰性結(jié)果，而這樣的結(jié)果是比假陽性結(jié)果危害大得多的，因此至今未推廣使用。而中國專利申請cn101373187a公開了一種通過單次實驗即可實現(xiàn)艾滋、乙肝、丙肝、梅毒這四種重大傳染病中的三到四項同時篩查的免疫層析試劑盒，其基于膠體金，所以這種試劑盒檢測靈敏度不高，而且混合劃線時也無法避免hiv檢測的假陰性結(jié)果。

為此，本發(fā)明人憑借長期在本領(lǐng)域深耕的經(jīng)驗，在經(jīng)歷大量實驗失敗的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)要開發(fā)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋體同時適用的高靈敏度、高精確度、高可靠性并且檢測方便迅速的免疫分析方法，需用多方面的協(xié)同改進，包括抗原或抗體的設(shè)計或選擇，抗原或抗體載體的選擇，顯示(發(fā)光)標(biāo)記物的制備，以及陰性對照和陽性對照等。本發(fā)明人最終開發(fā)出了同步檢測乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋體的檢測試劑盒，其不但靈敏度高、可靠性好，不易受人為操作因素影響，尤其是能夠避免hiv的假陰性檢測結(jié)果的出現(xiàn)，而且操作方便迅速，操作便于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于急診檢測等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種hbv、hcv、hiv和tp同時適用的高靈敏度、高精確度、高可靠性并且檢測方便迅速的同步檢測試劑盒及其免疫分析hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體中的應(yīng)用和其中試劑的制備方法等。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了同時檢測樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的免疫檢測試劑盒，其包括：

(1.1)第1.1容器，其中容納用hbsag抗體標(biāo)記的磁微粒；

(1.2)第1.2容器，其中容納用hcv抗原標(biāo)記的磁微粒；

(1.3)第1.3容器，其中容納用hiv抗原標(biāo)記的磁微粒；

(1.4)第1.4容器，其中容納用hivp24抗體標(biāo)記的磁微粒；

(1.5)第1.5容器，其中容納用tp抗原標(biāo)記的磁微粒；

(2.1)第2.1容器，其中容納與hbsag抗體偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.2)第2.2容器，其中容納與hcv抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.3)第2.3容器，其中容納與hiv抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.4)第2.4容器，其中容納與hivp24抗體偶聯(lián)的吖啶酯；

(2.5)第2.5容器，其中容納與tp抗原偶聯(lián)的吖啶酯；

(3)第三容器，其中容納hbsag陽性對照；

(4)第四容器，其中容納hcv陽性對照；

(5)第五容器，其中容納hiv陽性對照；

(6)第六容器，其中容納tp陽性對照；和，

(7)第七容器，其中容納陰性對照。

在本文中，樣品是潛在可能含有hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和/或抗體和/或tp抗體的離體樣品，如血液、血液制品、體液等。本發(fā)明的檢測方法所針對的目標(biāo)——病原體抗原和/或抗體，其中，病原體抗原是病原體的蛋白質(zhì)或片段，病原體抗體是人體免疫系統(tǒng)應(yīng)對相應(yīng)病原體自然產(chǎn)生的(多克隆)抗體。在本發(fā)明的具體實施方式中，可以同時檢測hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體。這些抗原和抗體能夠在一定程度上表征hbv、hcv、hiv和tp的存在性。

需要指出的是，本發(fā)明的檢測用于對離體樣品的檢測，檢測的直接結(jié)果是抗體的存在性與否，而并非診斷結(jié)果。即使對于利用本發(fā)明的檢測方法檢測人血液樣品中病原體抗原和抗體，也只能直接得出抗原和抗體的存在與否，還需要有經(jīng)驗的醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)人的體質(zhì)、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出檢測出的相應(yīng)抗原的量是否能致病、相應(yīng)抗體已經(jīng)遏制了病毒或不足以抵抗病毒的診斷結(jié)果或健康狀況。因此無法根據(jù)抗原、抗體的存在而直接判斷其攜帶者是否患有由這四種病原體帶來的疾病，所以本發(fā)明直接目的不是診斷。所以，本發(fā)明的試劑盒的應(yīng)用不屬于診斷方法。

在本文中，如無特別說明，“第1.1”、“第2.3”、“第三”、“第五”等序數(shù)詞僅僅是對具有相同或相似用途的物品或物質(zhì)的區(qū)分，并不對物品或物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、性質(zhì)和形狀等構(gòu)成限定。例如，第四容器和第五容器可以是材料、形狀完全相同的容器，但是是不同的容器，分別容納hcv陽性對照和hiv陽性對照。容器可以是瓶、管或杯，使得其中的容納物被分隔保存。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，用各抗體或抗原標(biāo)記的磁微?？梢曰旌先菁{于同一容器中，這樣不影響也便于四種病原體的同步檢測，即第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，如，第一容器。當(dāng)然，為了便于對同步檢測的陽性結(jié)果進行病原體區(qū)分，第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器可以是不同的容器。

也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，與各抗體或抗原偶聯(lián)的吖啶酯可以混合容納于同一容器中，這樣不影響也便于四種病原體的同步檢測，即第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，如，第二容器。當(dāng)然，為了便于對同步檢測的陽性結(jié)果進行病原體區(qū)分，第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器可以是不同的容器。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，hiv抗原的氨基酸序列如seqidno：1所示。本發(fā)明人設(shè)計的該抗原能方便地連接于發(fā)光標(biāo)記物和磁微粒上，仍舊保持效價高、特異性好的優(yōu)勢，并且涵蓋了hiv-i型和ii型的測定。該抗原能夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的重組方法生產(chǎn)，當(dāng)前已經(jīng)有商業(yè)渠道提供重組生產(chǎn)蛋白(抗原)的服務(wù)。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，磁微粒是粒徑0.90-1.10μm的含有羧基基團的磁微粒。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)這樣的磁微粒對本發(fā)明的抗原的標(biāo)記率高，施加磁力后聚集迅速，并且吸附一致性好。在本發(fā)明的具體實施方式中，磁微粒是em1-40/100型號的磁微粒。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，用各病原體的抗原或抗體標(biāo)記的磁微粒的制備方法包括：將edc和nhs混合溶于mes中，加入磁微粒，震蕩，棄上清液，清洗后加入各病原體的抗原或抗體進行標(biāo)記反應(yīng)，然后加入賴氨酸封閉，再洗滌。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，吖啶酯是吖啶琥珀酰亞胺酯。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)該吖啶酯基本不影響本發(fā)明的抗原效價，而且發(fā)光好。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，與各病原體的抗原或抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備方法包括：將吖啶琥珀酰亞胺酯的dmf溶液與各病原體的抗原或抗體的pb溶液混合，攪拌后加入賴氨酸封閉，再透析。

優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，陰性對照是hbsag、hcv、hiv和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清；hbsag陽性對照是hbsag檢測確認(rèn)呈陽性的人血清，優(yōu)選是hbsag檢測確認(rèn)呈陽性但hcv、hiv和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清；hcv陽性對照是hcv檢測確認(rèn)呈陽性的人血清，優(yōu)選是hcv檢測確認(rèn)呈陽性但hbsag、hiv和tp檢測確認(rèn)呈陰性的人血清；hiv陽性對照是hiv檢測確認(rèn)呈陽性的人血清，優(yōu)選是hiv檢測確認(rèn)呈陽性但hbsag、hcv和tp檢測確認(rèn)呈陰性的人血清；以及，tp陽性對照是tp檢測確認(rèn)呈陽性的人血清，優(yōu)選是tp檢測確認(rèn)呈陽性但hbsag、hcv和hiv檢測確認(rèn)呈陰性的人血清。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于操作人員水平的參差不齊，所以會出現(xiàn)帶有傾向性的檢測結(jié)果，通過設(shè)置這些對照，并且配合閾值判讀，可以有效避免檢測結(jié)果受人為操作因素的影響。在本發(fā)明的具體實施方式中，人血清是在60℃保溫1小時后過濾除菌而制備得到的。各人血清可在知情同意下由相應(yīng)人員捐贈，也可購自疾控中心。

在本文中，“任選”具有辭典意義，即涵蓋選或不選兩種情況的范圍。本發(fā)明第一方面的試劑盒任選還包括分別容納洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的容器，即可以包括這些容器，也可以不包括這些容器。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明第一方面的試劑盒還包括分別容納洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的容器。

更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的試劑盒中，洗液包含吐溫20；第一激發(fā)液包含硝酸和h2o2；第二激發(fā)液包含naoh；磁微粒稀釋液包含牛血清白蛋白和吐溫20；和/或，吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液包含牛血清白蛋白和吐溫20。其中，磁微粒稀釋液和吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的配方可以是相同的。

另外，本發(fā)明第一方面的試劑盒還可以包括記載其應(yīng)用(如本發(fā)明第二方面的應(yīng)用)的說明書。又如，本發(fā)明第一方面的試劑盒可以同磁板、微孔板和/或閃光發(fā)光儀等儀器搭配出售，因此本發(fā)明還提供包括本發(fā)明第一方面的試劑盒以及任選儀器的產(chǎn)品。

在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒在同時檢測樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法中的應(yīng)用；相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒在制備用于同時檢測樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的應(yīng)用中，同時檢測樣品中hbv抗原、hcv抗體、hiv抗原和抗體以及tp抗體的方法依次包括：

(1)將第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器中的磁微?；旌虾?如果第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，則直接取樣)，上樣于微孔板的各孔中并洗滌；

(2)向各孔中分別加入樣品、陰性對照、hbsag陽性對照、hcv陽性對照、hiv陽性對照和tp陽性對照并溫育；

(3)將第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器中吖啶酯混合后(如果第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，則直接取樣)，加入各孔中并溫育；

(4)微孔板施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體并洗滌；

(5)向各孔中同時滴加第一激發(fā)液和第二激發(fā)液，用閃光發(fā)光儀檢測各孔的相對發(fā)光單位；和，

(6)以所測得的陰性對照的相對發(fā)光單位乘以2.1倍，作為閾值，樣品檢測值高于或等于閾值者為陽性，低于閾值者為陰性，任一陽性對照的檢測值低于閾值，則從步驟(1)開始重新檢測。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以相對發(fā)光單位乘以2.1倍作為閾值，并且對陽性對照的檢測進行嚴(yán)格要求，可以有效避免不同操作人員引入的操作誤差。

在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的試劑盒的制備方法，其包括用hbsag抗體標(biāo)記磁微粒的制備，用hcv抗原標(biāo)記磁微粒的制備，用hiv抗原標(biāo)記磁微粒的制備，用hivp24抗體標(biāo)記磁微粒的制備，用tp抗原標(biāo)記磁微粒的制備，與hbsag抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hcv抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hiv抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，與hivp24抗體偶聯(lián)吖啶酯的制備，與tp抗原偶聯(lián)吖啶酯的制備，和陰性對照、hbsag陽性對照、hcv陽性對照、hiv陽性對照和tp陽性對照的制備，任選還包括洗液、第一激發(fā)液、第二激發(fā)液、磁微粒稀釋液和/或吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液的配制。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的試劑盒不但靈敏度高、精確度高、可靠性好，不易受人為操作因素影響，尤其是能夠有效避免hiv檢測的假陰性結(jié)果，而且操作方便迅速，操作便于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于急診檢測等。

為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。

另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。

具體實施方式

以下本文將通過具體的實施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子克隆實驗指南》(第三版)(coldspringharborlaboratorypress)、《細(xì)胞實驗指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《rna實驗技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社,北京,中國,2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社,北京,中國,1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施；其中的試劑均可通過商業(yè)渠道獲得，經(jīng)測試，磁微粒選用可購自默克(merck)公司的em1-40/100型號的磁微粒，吖啶酯選用可購自sigma-aldrich的吖啶琥珀酰亞胺酯。

實施例1乙型肝炎病毒(hbv)檢測試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時檢測四種病原體，其中的hbv檢測不適合使用hbv抗原，否則很容易造成假陽性結(jié)果，故而使用抗hbv抗原的抗體。經(jīng)測試，使用多克隆抗體將導(dǎo)致同時檢測結(jié)果很不穩(wěn)定，最終選擇了針對hbsag不同位點的單抗組合hbsab-1和hbsab-2(可購自菲鵬生物股份有限公司,貨號hbsab-1、hbsab-2)，盡管不是所測試中效價最高的單抗，但是在同時檢測中準(zhǔn)確性最好，故使用不同位點的hbsag單抗制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

1.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取200μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入hbsag-1單抗25μg，在25℃進行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

1.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μghbsag-2單抗26μl(蛋白濃度2.8mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯25μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

1.3陽性對照的制備

取hbsag檢測確認(rèn)呈陽性且hcv、hiv和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時后，過濾除菌即得，于2～8℃保存。

1.4陰性對照的制備

取hbsag、hcv、hiv和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時后，過濾除菌，即得，于2～8℃保存。實施例2-5的陰性對照均與該陰性對照相同，下文略。

實施例2丙型肝炎病毒(hcv)檢測試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時檢測四種病原體，其中的hcv檢測不適合使用hcv抗體，否則很容易造成假陽性結(jié)果，故而使用hcv抗原h(huán)cv12和hcv13(可購自廈門同仁心醫(yī)藥有限公司,貨號分別是hcv12、hcv13)，包含hcv的core、ns3、ns4、ns5抗原片段。經(jīng)測試，這些hcv抗原與hiv、tp抗原無交叉反應(yīng)，使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

2.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述hcv12抗原10μg，在25℃進行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

2.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μg上述hcv13抗原100μl(蛋白濃度1mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，與吖啶琥珀酰亞胺酯溶液20μl混合，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，然后加入含1％(w/v)賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％(w/v)，于室溫(25℃)封閉30分鐘，然后用0.01mpbs(ph6.3)進行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。

2.3陽性對照的制備

取hcv檢測確認(rèn)呈陽性且hbsag、hiv和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時后，過濾除菌即得，于2～8℃保存。

實施例3人免疫缺陷病毒(hiv)檢測試劑1的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時檢測四種病原體，其中的hiv檢測相當(dāng)復(fù)雜，故而在其檢測試劑1中使用hiv抗原。經(jīng)研究，委托合成了氨基酸序列如seqidno：1所示的hiv重組抗原，其可涵蓋hiv-1和hiv-ii型病毒的檢測，并與hcv、tp抗原無交叉反應(yīng)，使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

3.1標(biāo)記的磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述抗原10μg，在25℃進行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

3.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μg上述抗原71μl(蛋白濃度1.4mg/ml),用0.1mpb(ph8.0)透析，與吖啶琥珀酰亞胺酯溶液20μl混合，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，然后加入含1％(w/v)賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％(w/v)，于室溫(25℃)封閉30分鐘，然后用0.01mpbs(ph6.3)進行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。

3.3陽性對照的制備

取hiv檢測確認(rèn)呈陽性且hcv、hbsag和tp檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時后，過濾除菌即得，于2～8℃保存。實施例4的陽性對照與該陽性對照相同，下文略。

實施例4人免疫缺陷病毒(hiv)p24抗體檢測試劑2的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，hiv四代不僅檢測hivi型和ii型抗體，同時檢測hivp24抗原，其中的hiv檢測相當(dāng)復(fù)雜，同時檢測中假陽性和假陰性結(jié)果的消除很難用一種試劑完成，經(jīng)測試，hivp24抗體采用單克隆抗體p24-ab(可購自菲鵬生物股份有限公司,貨號p24-ab)，其與hiv抗原、hcv抗原、tp抗原以及hbsag單抗均無交叉反應(yīng)，對hiv檢測試劑1的缺點進行了有效彌補，故使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

4.1標(biāo)記磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取200μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入p24-ab單抗25μg，在25℃進行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

4.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μgp24單抗62.5μl(蛋白濃度1.6mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯25μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

實施例5梅毒螺旋體(tp)檢測試劑的確定

經(jīng)本發(fā)明人研究，如果要同時檢測四種病原體，其中的tp檢測不適合使用tp抗體，否則很容易造成假陽性結(jié)果，故而使用tp抗原。經(jīng)測試，采用tp重組抗原(購自杭州弘距生物技術(shù)有限公司，貨號tp)，其包含tp的15kd、17k、47kd抗原片段，與hiv、hcv抗原無交叉反應(yīng)，故使用它制備標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物。

5.1標(biāo)記磁微粒的制備

將碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)分別用0.05mph5.0的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)分別溶解定容至20mg/ml，各取100μl的edc和nhs溶液混合，加入1mg磁微粒，于室溫(25℃)震蕩混勻40分鐘，然后棄上清液，用0.1mpbs(ph7.4)清洗三次，最后一次清洗液不棄置，然后加入上述抗原30μg，在25℃進行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后加入賴氨酸，使之濃度達(dá)到25mm，反應(yīng)30分鐘，以封閉多余的位點，再用0.1mpbs(ph7.4)洗滌三次，獲得的標(biāo)記的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01mpbs(ph7.4)中，于2-8℃保存。

5.2吖啶酯偶聯(lián)物的制備

將吖啶琥珀酰亞胺酯用無水二甲基亞酰胺(dmf)溶解定容至0.2mg/ml,取100μgtp抗原66.7μl(蛋白濃度1.5mg/ml)，用0.1mpb(ph8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亞胺酯30μl，在室溫(25℃)下攪拌20分鐘，加入含1％賴氨酸的0.1mpb(ph8.0)，使賴氨酸的終濃度達(dá)到0.25％，室溫(25℃)封閉30分鐘，用0.01mpbs(ph6.3)進行透析，透析后加入甘油-20℃存放。

5.3陽性對照的制備

取tp檢測確認(rèn)呈陽性且hcv、hiv和hbsag檢測確認(rèn)均呈陰性的人血清，在60℃保溫1小時后，過濾除菌即得，于2～8℃保存。

實施例6同步檢測試劑盒

本發(fā)明的同步檢測試劑盒可以包括15個容器，分別裝有實施例1-5各自制備的標(biāo)記的磁微粒、實施例1-5各自制備的吖啶酯偶聯(lián)物、陰性對照、實施例1-3、5各自制備的陽性對照。該同步檢測試劑盒不但可以進行四種病原體的同步檢測，而且可以在同步檢測結(jié)果呈陽性后，使用其中的部分試劑檢測確認(rèn)具體的病原體。

當(dāng)然，如果僅為了同步檢測，實施例1-5各自制備的標(biāo)記的磁微?？梢曰旌涎b在一個容器中，實施例1-5各自制備的吖啶酯偶聯(lián)物也可以混合裝在一個容器中，這樣的同步檢測試劑盒可以僅包括7個容器。

另外，本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括分別裝有以下試劑的容器：洗液(其配方為：0.01m磷酸鹽緩沖液ph7.4、0.05％(v/v)吐溫20)、激發(fā)液a(其配方為：含0.05m硝酸溶液、0.15％(v/v)h2o2)和激發(fā)液b(其配方為：0.2mnaoh溶液)，另外還可以包括磁微粒稀釋液(其配方為：0.02m磷酸緩沖液ph7.4，1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％(v/v)吐溫20)和吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液(其配方為：0.02m磷酸緩沖液ph7.4、1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％(v/v)吐溫20)。

實施例7四種病原體的同步檢測

同步檢測的具體過程如下：

(1)將實施例1-5制備的5種標(biāo)記的磁微粒(用磁微粒稀釋液將磁微粒濃度稀釋至0.5μg/μl)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各種標(biāo)記的磁微粒各10μl，底部施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體；

(2)進行洗滌，每孔加300μl洗液，撤去磁力振蕩混勻后，靜置20秒，施加磁力，棄去孔中液體，如此共洗滌5次；

(3)向每孔中分別加入樣品、陰性對照、各種陽性對照50μl，37℃溫育20分鐘；

(4)將實施例1-5制備的5種吖啶酯偶聯(lián)物(用吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液將吖啶酯濃度稀釋至0.05μm)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各種吖啶酯偶聯(lián)物各10μl，置37℃溫育20分鐘，然后底部施加磁力以吸住磁微粒，棄去孔中液體；

(5)進行洗滌，其與步驟(2)相同，共洗滌5次；

(6)每孔同時滴加激發(fā)液a和激發(fā)液b各100μl，在滴加得同時用閃光發(fā)光儀(可購自promage公司)進行檢測各孔的相對發(fā)光單位(rlu)。

以所測得的陰性對照發(fā)光值的平均值乘以2.1倍，作為閾值，樣品發(fā)光值除以陰性對照發(fā)光平均值，高于或等于閾值者為陽性，低于閾值者為陰性。

對于檢測陽性的樣品，再單獨使用實施例1-5制備的標(biāo)記的磁微粒和吖啶酯偶聯(lián)物確認(rèn)具體的病原體，檢測步驟基本與上述步驟相同，所不同的是僅加10μl標(biāo)記的磁微粒并用磁微粒稀釋液補足至50μl，以及僅加10μl吖啶酯偶聯(lián)物并用吖啶酯偶聯(lián)物稀釋液補足至50μl。

使用上述方法對不同來源的曾經(jīng)被誤診的人血清樣品進行檢測，陽性對照和陰性對照之任一檢測出現(xiàn)異常的微孔板重新檢測(該板結(jié)果棄用)，檢測結(jié)果如下表所示，同步檢測僅在hcv和hiv樣品中出現(xiàn)微量假陽性結(jié)果，其中hiv樣品的假陽性結(jié)果可以用本發(fā)明的試劑盒本身進一步檢測排除，未出現(xiàn)假陰性結(jié)果，該檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性已經(jīng)超過現(xiàn)有的四種病原體的同步免疫檢測產(chǎn)品了；重復(fù)10孔檢測，變異系數(shù)(cv)介于4.24～12.71％，均≤15％，說明該方法精密性好。

序列表

<110>蘇州華益美生物科技有限公司

<120>四病原體同步檢測試劑盒及其應(yīng)用和制備

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