本發(fā)明涉及電化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于一種生物源納米硒顆粒修飾的玻碳電極及其制備方法，以及其在測定過氧化氫中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

過氧化氫(h2o2)是過氧化酶參與的酶促反應(yīng)產(chǎn)物，近來在工業(yè)、生物、環(huán)境、臨床診斷和食品分析等領(lǐng)域都有非常重要的作用，因此h2o2的檢測引起人們越來越多的關(guān)注。目前，檢測h2o2一般采用滴定、化學(xué)發(fā)光、熒光和電化學(xué)等方法，其中電化學(xué)分析方法由于具有較高的靈敏度、良好的線性范圍、快速而穩(wěn)定的響應(yīng)信號而被廣泛研究。在迄今為止開發(fā)的所有傳感器中，酶電極往往由于其制備復(fù)雜，消耗時間長，穩(wěn)定性差，不易長期保存，靈敏度大幅度下降而不能廣泛使用。因此，制備精確的，高靈敏度，快速，可靠和經(jīng)濟有效的h2o2測定傳感器成為現(xiàn)在的迫切需求?；诩{米顆粒化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、催化活性和表面活性高，易進行表面化學(xué)修飾等特點，被越來越多的應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的研究。

納米硒具有優(yōu)良的光導(dǎo)性，壓電效應(yīng)和熱電效應(yīng)等，已廣泛用于生產(chǎn)光電池，壓力傳感器，復(fù)印機，整流計和曝光計等。硒又是人體必需的重要微量元素，具有增強免疫能力，抗癌和防病等多種功能。近年來的研究結(jié)果表明，單質(zhì)納米硒材料具有更好的光電特性，其生物功能也更加優(yōu)異。張娟等于2007年在“無定形硒納米粒子的交聯(lián)酶模板法合成及其在生物傳感器中的應(yīng)用”一文中，公開了一種制備納米硒顆粒修飾的電極的方法并對其電化學(xué)性能進行了研究，該方法以戊二醛交聯(lián)的辣根過氧化物為模板合成了無定形納米硒顆粒，將該納米硒顆粒修飾到熱解石墨電極表面，在上面再次修飾上辣根過氧化物酶構(gòu)建生物傳感器測定過氧化氫。但其合成納米硒的方法屬于化學(xué)合成法，容易引起二次污染以及該方法屬于酶電極，制備復(fù)雜，消耗時間長，穩(wěn)定性差，不易長期保存，大大影響其的廣泛使用。

相對于物理和化學(xué)法等體外合成納米硒，生物合成被認為是一種清潔，無毒和環(huán)保的方法。在這其中，微生物中的細菌因其生長快速，易培養(yǎng)，價格低廉和收集容易被認為是生物合成納米硒的首選。本發(fā)明通過光合細菌制備獲得穩(wěn)定性和分散性良好的納米硒顆粒對電極進行修飾，得到的電極相較于現(xiàn)有技術(shù)具有制備方法簡單、快速、易于操作和穩(wěn)定性高等優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測過氧化氫的電極及其制備方法，電極的制備方法簡單，所制備的電極穩(wěn)定性好，能長期保存，可用于快速、靈敏準確的檢測過氧化氫。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種檢測過氧化氫的電極的制備方法，包括如下步驟：

1)納米硒顆粒的制備：按重量將光合細菌10-50份接入100份含有亞硒酸鹽濃度為0.5mmol/l-8.0mmol/l的培養(yǎng)基中，在15-40℃光照厭氧條件下培養(yǎng)3-10d；培養(yǎng)物在3000×g，4℃下離心10min，取上清液于18000×g，4℃離心60min，收集沉淀；將沉淀用50mmol/ltris-hcl(ph7.5)懸浮、18000×g離心60min，重復(fù)三次；收集沉淀；再用去離子水洗滌兩次，冷凍干燥，得高純度的納米硒顆粒。所述的納米硒顆粒為直徑80-200nm的球形納米硒顆粒；

上述培養(yǎng)基的成分及配比為：mgso4·7h2o100-300mg，cacl2·2h2o50-100mg，乙酸鈉1500-3000mg，edta10-30mg，酵母粉500-1500mg，k2hpo4500-1500mg，(nh4)2so41000-2000mg，feso4·7h2o5-15mg，kh2po4400-1000mg，微量元素溶液1-5ml，去離子水1000-2000ml，ph為5-9；

其中微量元素溶液組成及配比為：h3bo3200-300mg，mnso4·4h2o150-250mg，na2moo4·2h2o50-100mg，cuso42-10mg，znso4·7h2o20-30mg，去離子水100-200ml；

2)玻碳電極的預(yù)處理：先用0.05μm的al2o3漿對電極進行拋光，然后依次用1:1的稀硝酸、無水乙醇及二次蒸餾水對其進行超聲清洗，氮氣吹干備用；

3)納米硒顆粒修飾的玻碳電極的制備：稱取冷凍干燥的納米硒顆粒溶于二次蒸餾水中配成0.3～1.0mg/ml的修飾劑，并進行超聲處理使其均勻分散；取5～10μl該修飾劑滴涂于上述處理好的玻碳電極表面，并在紅外燈下照射晾干，即得到納米硒顆粒修飾的修飾電極。

所述的光合細菌為沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)。由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合細菌研究室分離、鑒定并保藏。該菌種文獻出處：張肇銘，楊素萍，趙春貴.沼澤紅假單胞菌的分離鑒定研究.山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1992，(4)：379-385。

過氧化氫的電化學(xué)測定：使用上述制備好的納米硒顆粒修飾的修飾電極作為電流型生物傳感器，具體測定方法如下：利用電化學(xué)工作站采用三電極系統(tǒng)對過氧化氫進行檢測，即工作電極為納米硒顆粒修飾的修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑柱電極；電解杯中加入5mlph為7.0的0.1m磷酸緩沖溶液，并通入氮氣以排除緩沖液中的溶解氧，加入適量過氧化氫后將三電極系統(tǒng)置于其中，選擇差分脈沖伏安法，設(shè)定掃描范圍為0.2v-1.1v，記錄相應(yīng)的峰電流信號，在0.1mm-5mm的過氧化氫濃度范圍內(nèi)，得出掃描峰電流值與過氧化氫濃度的線性關(guān)系，方程為：i(μa)＝0.843c(mm)-0.0159,相關(guān)系數(shù)為0.996，根據(jù)得出的線性關(guān)系及相應(yīng)的方程，可達到對過氧化氫的濃度進行檢測的目的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：

1.本發(fā)明使用的電極修飾材料為生物方法合成的納米硒顆粒，整個制備體系構(gòu)建容易，操作簡單，合成方法安全，高效，穩(wěn)定且不產(chǎn)生環(huán)境污染。而且，制得的產(chǎn)物粒徑較小，分布均勻，具有良好的分散性，且純度高。

2.本發(fā)明構(gòu)建的傳感器為無酶傳感器，無需嚴苛的檢測條件，好操作，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，易于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1納米硒顆粒的透射電鏡分析；

圖2納米硒顆粒的edx分析；

圖3為納米硒顆粒修飾的玻碳電極在0.1m的pbs緩沖溶液(ph7.0)中的差分脈沖伏安掃描圖，a線為加入5mmh2o2，b線為未加入h2o2；

圖4為標準過氧化氫濃度與峰電流的線性關(guān)系圖。

具體實施方式

實施例1納米硒顆粒的制備

按下列組份配置培養(yǎng)基：mgso4·7h2o150mg，cacl2·2h2o80mg，乙酸鈉1800mg，edta20mg，酵母粉1200mg，k2hpo41000mg，(nh4)2so41500mg，feso4·7h2o10mg，kh2po4800mg，微量元素溶液3ml，去離子水1000ml，ph為7。其中微量元素溶液組成為：h3bo3240mg，mnso4·4h2o200mg，na2moo4·2h2o70mg，cuso47mg，znso4·7h2o24mg，去離子水100ml。

在經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基中接入1/10份數(shù)的光合細菌，在光照強度為1500lux、30℃、厭氧條件下，培養(yǎng)5d，重復(fù)二次，作為接種菌種備用。將上述活化的光合細菌菌液接種于含1.0mmol/l亞硒酸鹽培養(yǎng)基中，接總量為15％，在光照強度1500lux、30℃、厭氧條件下，培養(yǎng)7d。培養(yǎng)物在3000×g、4℃下離心10min，收集上清液于18000×g、4℃離心60min。棄去上清液，沉淀用50mmol/ltris-hcl(ph7.5)重新懸浮，18000×g離心60min，收集沉淀再次用50mmol/ltris-hcl(ph7.5)重新懸浮，18000×g離心60min，收集沉淀并再重復(fù)一次，所得固體產(chǎn)物經(jīng)洗滌、干燥，即得高純度的紅色納米硒顆粒。

樣品的透射電子顯微鏡照片由日本電子株式會社jem-1011型透射電鏡獲得。edx圖譜由link-inca超薄窗口能譜儀測定。樣品的制備是將樣品用無水乙醇超聲分散后，取溶液一滴滴于鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，待酒精揮發(fā)直接用于觀察。透射電子顯微鏡結(jié)果如圖1所示，顆粒近似球形，粒徑80-200nm。edx能譜分析如圖2所示，在0.274kev和8.038kev出現(xiàn)了c和cu元素的特征異吸收峰，這是銅網(wǎng)和所噴碳膜的吸收峰。在1.37kev、11.22kev和12.49kev出現(xiàn)元素硒的特異吸收峰，表明顆粒的主要成分為元素硒，與文獻報道一致，確定其為納米硒顆粒。

實施例2納米硒顆粒修飾的玻碳電極的制備

1)玻碳電極的預(yù)處理：使用0.05μm的al2o3漿在麂皮上進行打磨至表面光亮，用二次蒸餾水沖凈，并依次在1:1的稀硝酸，無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗，后用氮氣吹干備用。

2)稱取適量的納米硒顆粒溶于二次蒸餾水中，制得濃度為0.5mg/ml的修飾劑，超聲處理使其分散均勻，取5μl的納米硒顆粒修飾劑滴涂在上述預(yù)處理過的玻碳電極表面，并用紅外燈烘干，得到納米硒顆粒修飾的玻碳電極。

實施例3過氧化氫電化學(xué)測試

修飾電極對過氧化氫的檢測，方法如下：在電解杯中加入5ml磷酸緩沖溶液(pbs)(ph7.0)，通入氮氣以消除其中的溶解氧，加入適量的標準過氧化氫使其中具有不同濃度的過氧化氫，使用硒納米顆粒修飾的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑柱電極為輔助電極組成三電極系統(tǒng)，放入電解杯中，連接電化學(xué)工作站，在電化學(xué)工作站上選擇差分脈沖伏安法，掃描范圍為0.2v1.1v，記錄掃描不同濃度時對應(yīng)的峰電流值，在0.1mm-5mm的濃度范圍內(nèi)，得出掃描峰電流值與過氧化氫濃度的線性關(guān)系，方程為：

i(μa)＝0.843c(mm)-0.0159,相關(guān)系數(shù)為0.996，根據(jù)得出的線性關(guān)系及相應(yīng)的方程，可達到對過氧化氫的濃度進行檢測的目的。測試結(jié)果在圖3和圖4中顯示。