本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，igkc、c9、ahsg和kng1在區(qū)分結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

正常人胸腔內(nèi)約有5-15ml液體將兩層胸膜分開(kāi)，在呼吸運(yùn)動(dòng)時(shí)起潤(rùn)滑作用。胸腔液體量并非固定不變，正常人每24小時(shí)亦有500-1000ml的液體滲出與再吸收，兩者處于平衡狀態(tài)。任何原因造成其滲出增多和(或)再吸收減少，出現(xiàn)胸膜腔內(nèi)液體增多時(shí)則產(chǎn)生胸腔積液。胸腔積液常見(jiàn)為結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液。結(jié)核性胸腔積液由結(jié)核性胸膜炎導(dǎo)致，結(jié)核性胸膜炎由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致，結(jié)核性胸膜炎是臨床上常見(jiàn)的肺外結(jié)核病，發(fā)病率較高，但由于診斷技術(shù)限制，確診比例非常低。惡性胸腔積液由惡性胸膜疾病導(dǎo)致，惡性胸膜疾病包括原發(fā)性惡性胸膜腫瘤以及其他部位惡性腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移，大約50％轉(zhuǎn)移性腫瘤患者在疾病過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)胸腔積液。結(jié)核性胸腔積液與惡性胸腔積液的預(yù)后和治療完全不同，若得不到及時(shí)的診斷治療，將直接影響預(yù)后，但目前鑒別這兩種胸腔積液仍然是臨床的一大難題。

結(jié)核性胸膜炎的確診依據(jù)之一是在胸腔積液中找到結(jié)核分枝桿菌，但目前在胸腔積液涂片找到抗酸桿菌的靈敏度極低(0％-1％)，胸腔積液培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌靈敏度在11％-50％，而且需要2-4周的培養(yǎng)時(shí)間；另一種方法是胸膜組織活檢發(fā)現(xiàn)結(jié)核性肉芽腫、干酪性壞死或有抗酸桿菌存在，但此項(xiàng)檢查創(chuàng)傷較大，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高。胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)惡性胸腔積液的診斷具有重要的意義，胸腔積液中查到癌細(xì)胞或取得組織學(xué)診斷乃是惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性率較低(30％-60％)，尤其是較早期異形性不太明顯的癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞幾乎無(wú)法區(qū)別，以至造成診斷結(jié)果中存在著相當(dāng)數(shù)量的假陰性。胸腔鏡檢查對(duì)惡性胸腔積液的診斷具有較高的價(jià)值，但因費(fèi)用昂貴，操作難度大且有一定的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，患者較難接受。傳統(tǒng)的生化免疫學(xué)檢查如纖維連接蛋白、腺苷脫氨酶、鐵蛋白、溶菌酶以及胸腔積液血清白蛋白比值檢測(cè)，有利于胸腔積液的診斷，但敏感性和特異性均不令人滿意。近年來(lái)，一些先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于胸腔積液的檢測(cè)，如核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病領(lǐng)域的發(fā)展比較快，但其診斷結(jié)核性胸腔積液的陽(yáng)性率并非如人們所預(yù)料的那樣高，依然存在假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題，而且實(shí)驗(yàn)條件要求高，目前難以推廣。因此，開(kāi)發(fā)一種新的快速的早期診斷方法或技術(shù)，對(duì)于診斷和鑒別診斷結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜疾病，減少醫(yī)療資源消耗，將有重要意義。

胸腔積液中蛋白質(zhì)組組成成分、表達(dá)水平和疾病有密切聯(lián)系，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組，對(duì)鑒別診斷結(jié)核行胸膜炎和惡性胸膜疾病有重要意義。lablefree2d-lc-msms將非同位素標(biāo)記技術(shù)、二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相聯(lián)用，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比的峰，根據(jù)波峰的高度及面積可得到準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者。

本發(fā)明首先提供了檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)在制備區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)可包括檢測(cè)igkc含量的系統(tǒng)、檢測(cè)c9含量的系統(tǒng)、檢測(cè)ahsg含量的系統(tǒng)和檢測(cè)kng1含量的系統(tǒng)。

上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)igkc含量的系統(tǒng)可為下述a1)或a2)：

a1)通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)igkc含量所需的試劑和/或儀器；

a2)利用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器；

所述檢測(cè)c9含量的系統(tǒng)可為下述b1)或b2)：

b1)通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)c9含量所需的試劑和/或儀器；

b2)利用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器；

所述檢測(cè)ahsg含量的系統(tǒng)可為下述c1)或c2)：

c1)通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)ahsg含量所需的試劑和/或儀器；

c2)利用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器；

所述檢測(cè)kng1含量的系統(tǒng)可為下述d1)或d2)：

d1)通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)kng1含量所需的試劑和/或儀器；

d2)利用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)含量所需的試劑和/或儀器。

上述應(yīng)用中，a1)所述通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)igkc含量所需的試劑可包括igkc和/或igkc的抗體；

b1)所述通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)c9含量所需的試劑可包括c9和/或c9的抗體；

c1)所述通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)ahsg含量所需的試劑可包括ahsg和/或ahsg的抗體；

d1)所述通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)kng1含量所需的試劑可包括kng1和/或kng1的抗體。

上述應(yīng)用中，a1)可僅為igkc和/或igkc的抗體，也可僅為檢測(cè)igkc含量的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒，也可由igkc和/或igkc的抗體或所述試劑盒與所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成；

b1)可僅為c9和/或c9的抗體，也可僅為檢測(cè)c9含量的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒，也可由c9和/或c9的抗體或所述試劑盒與所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成；

c1)可僅為ahsg和/或ahsg的抗體，也可僅為檢測(cè)ahsg含量的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒，也可由ahsg和/或ahsg的抗體或所述試劑盒與所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成；

d1)可僅為kng1和/或kng1的抗體，也可僅為檢測(cè)kng1含量的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒，也可由kng1和/或kng1的抗體或所述試劑盒與所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

a1)、b1)、c1)和d1)中所述試劑盒均可為英國(guó)abcam公司的酶聯(lián)免疫反應(yīng)(elisa)試劑盒，a1)中所述試劑盒的貨號(hào)可為cat^#ab157709；b1)中所述試劑盒的貨號(hào)可為cat^#ab137972；c1)中所述試劑盒的貨號(hào)可為cat^#ab108875；d1)中所述試劑盒的貨號(hào)可為cat^#ab108855。

所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)還可包括m1，m1為進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的定量和/或蛋白質(zhì)的酶解所需的試劑和/或儀器。

上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)還可包括數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)用于根據(jù)待測(cè)對(duì)象的igkc、c9、ahsg和kng1含量確定所述待測(cè)對(duì)象是結(jié)核性胸腔積液患者還是惡性胸腔積液患者；所述待測(cè)對(duì)象為胸腔積液患者。

具體來(lái)說(shuō)，所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)可僅由所述檢測(cè)igkc含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)c9含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)ahsg含量的系統(tǒng)和所述檢測(cè)kng1含量的系統(tǒng)組成，還可由所述檢測(cè)igkc含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)c9含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)ahsg含量的系統(tǒng)和所述檢測(cè)kng1含量的系統(tǒng)以及所述m1組成，也可由所述檢測(cè)igkc含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)c9含量的系統(tǒng)、所述檢測(cè)ahsg含量的系統(tǒng)和所述檢測(cè)kng1含量的系統(tǒng)以及所述m1與所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

上述應(yīng)用中，a2)、b2)、c2)和d2)的所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可包括依據(jù)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果確定igkc、c9、ahsg和kng1蛋白質(zhì)含量的功能。所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所需的軟件或模塊，如提取一級(jí)質(zhì)譜定量信息的軟件或模塊、進(jìn)行蛋白質(zhì)定量的軟件或模塊或進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和整合的軟件或模塊。所述提取一級(jí)質(zhì)譜定量信息的軟件或模塊可為trans-proteomicpipeline軟件，所述進(jìn)行蛋白質(zhì)定量的軟件或模塊可為profileanalysis2.0軟件，所述進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和整合的軟件或模塊可為proteinscape2.1軟件。

所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可為利用cart算法(請(qǐng)核實(shí))進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

所述igkc、c9、ahsg和kng1含量均可為胸腔積液中igkc、c9、ahsg和kng1的含量。

本發(fā)明還提供了以igkc、c9、ahsg和kng1作為標(biāo)志物的區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的系統(tǒng)在下述x1或x2中的應(yīng)用：

x1、制備區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者產(chǎn)品；

x2、區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者。

上述應(yīng)用中，所述區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的系統(tǒng)可為所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)。

本發(fā)明還提供了igkc、c9、ahsg和kng1作為區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的標(biāo)志物在區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品為所述檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)。

本發(fā)明還提供了非診斷目的的區(qū)分或輔助區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的方法，所述方法包括檢測(cè)待測(cè)胸腔積液患者的igkc、c9、ahsg和kng1的含量，根據(jù)待測(cè)胸腔積液患者的igkc、c9、ahsg和kng1的含量確定待測(cè)胸腔積液患者是結(jié)核性胸腔積液患者還是惡性胸腔積液患者，具體如下：

a、在igkc的含量<7.143mg/ml時(shí)，根據(jù)a1)和a2)區(qū)分兩種患者：

a1)c9的含量≥134.727μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為結(jié)核性胸腔積液患者；

a2)c9的含量<134.727μg/ml，根據(jù)a11)和a12)區(qū)分兩種患者：

a11)ahsg的含量<114.061μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為惡性胸腔積液患者；

a12)ahsg的含量≥114.061μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為結(jié)核性胸腔積液患者；

b、在igkc的含量≥7.143mg/ml時(shí)，根據(jù)b1)和b2)區(qū)分兩種患者：

b1)kng1的含量≥64186.1μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為惡性胸腔積液患者；

b2)kng1的含量<64186.1μg/ml，根據(jù)b21)和b22)區(qū)分兩種患者：

b21)c9的含量<2.0613μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為惡性胸腔積液患者；

b22)c9的含量≥2.0613μg/ml，根據(jù)b221)和b222)區(qū)分兩種患者：

b221)ahsg的含量<68.698μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為惡性胸腔積液患者；

b222)ahsg的含量≥68.698μg/ml，所述待測(cè)胸腔積液患者為或候選為結(jié)核性胸腔積液患者。

本發(fā)明中，igkc為免疫球蛋白κ鏈c蛋白(immunoglobulinkappaconstantigkc)；c9為補(bǔ)體c9(complementcomponent9)；kng1為激肽原-1(kininogen1)蛋白；ahsg為α2-hs-糖蛋白(alpha-2-hs-glycoprotein)。

本發(fā)明中，所述igkc、c9、ahsg和kng1含量均可為胸腔積液中igkc、c9、ahsg和kng1的含量。

本發(fā)明中，所述結(jié)核性胸腔積液患者可符合以下第①～③項(xiàng)以及第④～⑥項(xiàng)這三項(xiàng)中的至少一項(xiàng)：①臨床有低熱、盜汗、消瘦、胸痛、干咳等臨床癥狀；②胸腔積液符合滲出液改變，胸腔積液細(xì)胞成份以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，胸腔積液腺苷脫氨酶(ada)大于45u/l；③經(jīng)抗結(jié)核治療后胸腔積液吸收，臨床癥狀緩解，并除外合并有其它細(xì)菌感染等其它原因所致胸腔積液；④胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；⑤胸膜活組織檢查病理有典型的結(jié)核病變；⑥合并有肺結(jié)核，痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或集菌陽(yáng)性。

所述惡性胸腔積液患者可符合以下條件：胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查找到惡性腫瘤細(xì)胞或胸膜活檢確診胸膜組織中存在腫瘤細(xì)胞，并除外合并有細(xì)菌和結(jié)核感染等其它原因所致胸腔積液。

所述結(jié)核性胸腔積液患者和所述惡性胸腔積液患者均可無(wú)以下任意一項(xiàng)特征：①患者在入院前的既往3個(gè)月內(nèi)，曾接受任何關(guān)于有創(chuàng)性胸膜腔檢查和(或)治療，或者罹患有胸部外傷者；②患者曾接受過(guò)抗腫瘤治療，或患者曾接受抗結(jié)核治療超過(guò)2周?；颊呤褂眠^(guò)糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥，或免疫抑制劑者；③患者還合并有其他免疫因素性疾??；④患者胸腔積液的病因診斷不清楚者；⑤合并肝臟、腎臟等影響蛋白質(zhì)的疾病。

所述結(jié)核性胸腔積液患者和所述惡性胸腔積液患者均可大于等于18歲和/或hiv陰性。

利用本發(fā)明的檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的準(zhǔn)確性為97.5％；篩查惡性胸腔積液患者的靈敏度為100％，特異度為96％；篩查結(jié)核性胸腔積液患者的靈敏度為96％，特異度為100％。表明，可利用本發(fā)明的檢測(cè)igkc、c9、ahsg和kng1含量的系統(tǒng)區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者。

附圖說(shuō)明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為四種蛋白質(zhì)通過(guò)elisa驗(yàn)證在結(jié)核性胸腔積液(tb-pe)和惡性胸腔積液(mpe)的變化趨勢(shì)。

圖3為四種蛋白質(zhì)建立疾病診斷模型。tumor表示惡性胸腔積液患者，

tuberculosis表示結(jié)核性胸腔積液患者。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的差異性蛋白

一、結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者差異性蛋白的發(fā)現(xiàn)

1、樣本和儀器

5例選自tpe(結(jié)核性胸腔積液)患者，另外5例為mpe(惡性胸腔積液)患者，均有實(shí)驗(yàn)室及臨床診斷報(bào)告確定。

結(jié)核性胸腔積液患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，hiv陰性。具有以下第1～3項(xiàng)合并4～6項(xiàng)中任何一項(xiàng)者可納入：①臨床有低熱、盜汗、消瘦、胸痛、干咳等臨床癥狀；②胸腔積液符合滲出液改變，胸腔積液細(xì)胞成份以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，胸腔積液腺苷脫氨酶(ada)大于45u/l；③經(jīng)抗結(jié)核治療后胸腔積液吸收，臨床癥狀緩解，并除外合并有其它細(xì)菌感染等其它原因所致胸腔積液；④胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；⑤胸膜活組織檢查病理有典型的結(jié)核病變；⑥合并有肺結(jié)核，痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或集菌陽(yáng)性。

惡性胸腔積液患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，hiv陰性。胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查找到惡性腫瘤細(xì)胞或胸膜活檢確診胸膜組織中存在腫瘤細(xì)胞，并除外合并有細(xì)菌和結(jié)核感染等其它原因所致胸腔積液。

排除標(biāo)準(zhǔn)：上述結(jié)核性胸腔積液患者或者惡性胸腔積液患者，凡是符合以下任意一項(xiàng)者皆排除：①患者在入院前的既往3個(gè)月內(nèi)，曾接受任何關(guān)于有創(chuàng)性胸膜腔檢查和(或)治療，或者罹患有胸部外傷者；②患者曾接受過(guò)抗腫瘤治療，或患者曾接受抗結(jié)核治療超過(guò)2周。患者使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥，或免疫抑制劑者；③患者還合并有其他免疫因素性疾病；④患者胸腔積液的病因診斷不清楚者；⑤合并肝臟、腎臟等影響蛋白質(zhì)的疾病。

所有的患者胸水(即胸腔積液)樣本均在清晨空腹下抽取，分離胸腔積液后儲(chǔ)存在-80低溫冰箱中。

采用lablefree2d-lc-msms檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)用儀器是液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(q-exactivethermofinnigan)，電泳儀(bio-rad,美國(guó))，multiskans酶標(biāo)儀(thermo,美國(guó))，白蛋白/igg去除試劑盒為德國(guó)merck公司產(chǎn)品。

2、蛋白質(zhì)提取

采用默克(merck)公司的proteoextractalbumin/iggremovalkit去除樣本中的高豐度蛋白(白蛋白/igg)。去高速離心后的胸腔積液樣本50μl，在冰上按使用說(shuō)明書(shū)操作處理，處理后的樣本體積1800μl。

由于樣本經(jīng)過(guò)去除高豐度蛋白處理后，濃度被稀釋了300倍，因此需要對(duì)樣本進(jìn)行濃縮處理。1800μl處理后的樣本加入8ml-20℃預(yù)冷丙酮，沉淀過(guò)夜。6000g離心后，棄去上清，晾干丙酮后，用100μl溶解液(7m尿素和2m硫脲)溶解沉淀。溶解后的樣本4℃下40000g離心30min，作為待測(cè)樣本，待用。

3、蛋白質(zhì)定量

采用thermoscientificpiercebca蛋白定量分析試劑盒，貨號(hào)：nci3225ch。

a.方法

(1)開(kāi)分光光度計(jì)預(yù)熱20min，選擇“光度測(cè)量”，調(diào)節(jié)λ＝595nm。

(2)用ck(2μl裂解緩沖液+18μlddh2o+1mlbradford)進(jìn)行調(diào)零三次。(要點(diǎn)：第一次按“zero”即可，觀察第二、三次的od值，如果都很小且相差不大即可。調(diào)零完畢后，顯示“-0.301abs”。)

(3)配置表1中的各牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液并測(cè)定od595值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)測(cè)b2(2μlbsa+18μlddh2o+1mlbradford)、b5(5μlbsa+15μlddh2o+1mlbradford)、b8(8μlbsa+12μlddh2o+1mlbradford)各三管，用于確定校正系數(shù)，校正蛋白濃度。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算方法為：在excel表格中，一列蛋白質(zhì)濃度，一列對(duì)應(yīng)od值，插入圖標(biāo)，選擇折線圖，選項(xiàng)中選擇顯示r值和公式。

注：bsa表示牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；要點(diǎn)：所有管加好bsa和ddh2o后，加一管bradford，測(cè)一管；動(dòng)作要領(lǐng)“三搖一拍”；讀值為放入比色皿1s后的第一個(gè)值；如有數(shù)值異?？缮釛壸x值或多做一次重復(fù)。

(5)測(cè)待測(cè)樣本蛋白o(hù)d595值。操作同上。將od595值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到蛋白濃度測(cè)定值，進(jìn)而計(jì)算實(shí)際蛋白濃度，實(shí)際蛋白濃度＝蛋白濃度測(cè)定值×校正系數(shù)。

表1、牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的設(shè)置及od595值測(cè)定結(jié)果

b.結(jié)果

根據(jù)表1測(cè)定結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.038x+0.029，r²＝0.989。其中，x為od595，y為蛋白濃度。具體見(jiàn)圖1。

根據(jù)上述步驟(4)計(jì)算得到校正系數(shù)為0.989。

4、胰蛋白酶解樣本

(1)蛋白質(zhì)定量后取200μg蛋白溶液置于離心管中，用8m尿素溶液將體系定至125μl；

(2)加入現(xiàn)配的5μl1mdtt溶液至體系中，混勻后，37℃孵育1h；

(3)加入現(xiàn)配的20μl1miaa溶液至體系中，混勻后，避光，室溫(25℃)反應(yīng)1h；

(4)吸取所有樣品加入到10kd超濾管中，12000rpm(不超過(guò)14000g)離心20min，棄掉收集管底部溶液；

(5)加入100μl尿素溶液(8m)至超濾管中，12000rpm離心10min，重復(fù)2次。

(6)在超濾管中加入胰蛋白酶(100u/μg)2-4μg(與蛋白質(zhì)量比1:50-100)，體積50μl，37℃反應(yīng)過(guò)夜20h；次日，12000rpm離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部。

5、液相分級(jí)以及蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)

取酶解產(chǎn)物，按照定量結(jié)果取10μg進(jìn)行l(wèi)cmsms分析。采用納升流速hplc液相系統(tǒng)easy-nlc1000進(jìn)行分離。液相a液為含有2％(體積分?jǐn)?shù))乙腈和0.1％(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液(即以100ml計(jì)算組成如下：2ml乙腈，0.1ml甲酸，余量為水)，b液為含有84％(體積分?jǐn)?shù))乙腈和0.1％(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液(即以100ml計(jì)算組成如下：84ml乙腈，0.1ml甲酸，余量為水)。色譜柱thermoeasycolumnsc200150μm×100mm(rp-c18)以100％的a液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到thermoeasycolumnsc001traps150μm×20mm(rp-c18)(thermo)，再經(jīng)色譜柱分離，流速為400nl/min。相關(guān)液相梯度如下：0min-100min，b液線性梯度從0％到45％(體積百分比含量，下同)；100min-108min，b液線性梯度從45％到100％；108min-120min，b液維持在100％。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用q-exactive質(zhì)譜儀(thermofinnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)：120min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(fullscan)后采集10個(gè)碎片圖譜(ms2scan，hcd)。ms1在m/z200時(shí)分辨率為70000，ms2在m/z200時(shí)分辨率為17500。

6、質(zhì)譜鑒定

先利用trans-proteomicpipeline軟件提取一級(jí)質(zhì)譜定量信息(采用軟件默認(rèn)參數(shù))，利用profileanalysis2.0軟件進(jìn)行定量(采用軟件默認(rèn)參數(shù))。然后利用proteinscape2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和整合，具體如下：

以peptidefdr≤0.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選過(guò)濾。導(dǎo)入maxquant軟件(屬于proteinscape2.1軟件的一部分)進(jìn)行l(wèi)abel-free分析。主要參數(shù)如下：

mainsearchppm：6missedcleavage：2

ms/mstoleranceppm：20de-isotopic：true

enzyme：trypsindatabase：ipi.human.3.87.fasta

fixedmodification：carbamidomethyl(c)

variablemodification：oxidation(m)，acetyl(proteinn-term)

decoydatabasepattern：reverse

lablefreequantification(lfq)：true

lfqminratiocount：2

matchbetweenruns：2min

peptidefdr：0.05

proteinfdr：0.05

篩選出4個(gè)foldchange(比值)＞1.5或者<0.6的差異蛋白，從而獲得區(qū)分tpe(結(jié)核性胸腔積液)和mpe(惡性胸腔積液)患者蛋白特征譜。其中，比值＞1.5的蛋白為表達(dá)上調(diào)的蛋白，比值<0.6的蛋白為表達(dá)下調(diào)的蛋白，所述比值為所述tpe(結(jié)核性胸腔積液)患者的相應(yīng)蛋白的平均表達(dá)量與所述mpe(惡性胸腔積液)患者的對(duì)應(yīng)蛋白的平均表達(dá)量的比值。

最終所得區(qū)分tpe患者和mpe患者蛋白特征譜中含有表達(dá)差異的4種蛋白質(zhì)，tpe患者和mpe患者比較存在差異的蛋白質(zhì)包括表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)和表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)；所述表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為igkc、c9和ahsg；所述表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)為kng1。

免疫球蛋白κ鏈c蛋白(immunoglobulinkappaconstant,igkc)，是免疫球蛋白分泌片段，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

補(bǔ)體c9(complementcomponent9，c9)，屬于補(bǔ)體家族的一員，是存在于人和脊椎動(dòng)物血清與組織液中的一種具有酶活性的蛋白質(zhì)，是機(jī)體的重要防御因子。

激肽原-1(kininogen1,kng1)蛋白，由kng1基因編碼，屬于激肽釋放酶激肽系統(tǒng)。

α2-hs-糖蛋白(alpha-2-hs-glycoprotein,ahsg)，又稱胎球蛋白a，是一種血清和組織蛋白，主要由肝臟分泌，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的主要系統(tǒng)性鈣化抑制物，與鼠pp63同源，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員之一，是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑。

二、elisa驗(yàn)證igkc、c9、kng1、ahsg蛋白在結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的差異

待測(cè)對(duì)象：50例tpe(結(jié)核性胸腔積液)患者，均符合步驟一結(jié)核性胸腔積液的條件；30例mpe(惡性胸腔積液)患者，均符合步驟一惡性胸腔積液的條件。

取各患者的胸水(胸腔積液)，利用elisa方法檢測(cè)igkc、c9、kng1、ahsg蛋白的含量，檢測(cè)igkc、c9、kng1、ahsg蛋白所使用的試劑盒分別為英國(guó)abcam公司的elisa試劑盒，檢測(cè)igkc的試劑盒的貨號(hào)為cat^#ab157709，該試劑盒中含有作為標(biāo)準(zhǔn)品的igkc和igkc抗體；檢測(cè)c9的試劑盒的貨號(hào)為cat^#ab137972，該試劑盒中含有作為標(biāo)準(zhǔn)品的c9和c9抗體；檢測(cè)kng1的試劑盒的貨號(hào)為cat^#ab108875，該試劑盒中含有作為標(biāo)準(zhǔn)品的kng1和kng1抗體；檢測(cè)ahsg的試劑盒的貨號(hào)為cat^#ab108855，該試劑盒中含有作為標(biāo)準(zhǔn)品的ahsg和ahsg抗體。所用儀器為thermomultiskanmk3。具體步驟如下：

1.加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加100μl稀釋液，余孔加待測(cè)樣本100μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2小時(shí)。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.每孔加檢測(cè)溶液a工作液100μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時(shí)。

4.棄去孔內(nèi)液體，每孔加350μl洗滌液洗滌，浸泡2min，甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在試驗(yàn)臺(tái)上鋪幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍打，重復(fù)洗板3次，最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。

5.每孔加檢測(cè)溶液b工作液100μl，加上覆膜，37℃溫育30min。

6.棄去孔內(nèi)溶液，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7.每孔加底物溶液90μl，加上覆膜，37℃避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在25min內(nèi))。

8.每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色變黃色，終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一，輕晃酶標(biāo)板使溶液混合均勻。

9.在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(od值)。

結(jié)果如圖2與表2所示。

表2、四種蛋白在結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的含量的elisa結(jié)果

結(jié)果顯示，igkc、c9、ahsg蛋白在結(jié)核性胸腔積液中的含量顯著高于相應(yīng)蛋白在惡性胸腔積液的含量；kng1蛋白在結(jié)核性胸腔積液中的含量顯著低于相應(yīng)蛋白在惡性胸腔積液的含量。

利用cart決策樹(shù)分析建立根據(jù)待測(cè)對(duì)象胸水樣本中igkc、c9、ahsg和kng1的含量區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的模型，待測(cè)對(duì)象為胸腔積液患者，該模型如下：

a、在igkc的含量<7.143mg/ml時(shí)，根據(jù)a1)和a2)確定兩種患者：

a1)c9的含量≥134.727μg/ml，待測(cè)對(duì)象為結(jié)核性胸腔積液患者；

a2)c9的含量<134.727μg/ml，根據(jù)a11)和a12)確定兩種患者：

a11)ahsg的含量<114.061μg/ml，待測(cè)對(duì)象為惡性胸腔積液患者；

a12)ahsg的含量≥114.061μg/ml，待測(cè)對(duì)象為結(jié)核性胸腔積液患者；

b、在igkc的含量≥7.143mg/ml時(shí)，根據(jù)b1)和b2)確定兩種患者：

b1)kng1的含量≥64186.1μg/ml，待測(cè)對(duì)象為惡性胸腔積液患者；

b2)kng1的含量<64186.1μg/ml，根據(jù)b21)和b22)確定兩種患者：

b21)c9的含量<2.0613μg/ml，待測(cè)對(duì)象為惡性胸腔積液患者；

b22)c9的含量≥2.0613μg/ml，根據(jù)b221)和b222)確定兩種患者：

b221)ahsg的含量<68.698μg/ml，待測(cè)對(duì)象為惡性胸腔積液患者；

b222)ahsg的含量≥68.698μg/ml，待測(cè)對(duì)象為結(jié)核性胸腔積液患者。

利用該模型區(qū)分結(jié)核性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者的結(jié)果如圖3所示，正確篩查惡性胸腔積液患者30例(22例+5例+1例+2例)活動(dòng)性結(jié)核病患者與48例(1例+2例+45例)結(jié)核性胸腔積液患者，準(zhǔn)確性為(30+48)/(30+50)×100％＝97.5％；篩查惡性胸腔積液患者的靈敏度為30/30×100％＝100％，特異度為48/50×100％＝96％；篩查結(jié)核性胸腔積液患者的靈敏度為48/50×100％＝96％，特異度為30/30×100％＝100％。