本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種化療藥物相關(guān)分子特異性蛋白芯片及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物芯片技術(shù)傳統(tǒng)上包括基因芯片和蛋白芯片，前者通過(guò)核苷酸的互補(bǔ)原理在芯片上固定的cdna探針和待測(cè)dna(或rna)雙鏈之間形成氫鍵，通過(guò)雜交反應(yīng)以及雜交后熒光強(qiáng)度的分析獲取待測(cè)樣本中特定基因的相對(duì)表達(dá)量，從而對(duì)來(lái)自不同條件的樣本進(jìn)行半定量比較,從而獲得相關(guān)疾病的基因表達(dá)譜特征。蛋白芯片是將蛋白質(zhì)、抗體或肽鏈固定在玻片或硝酸纖維膜上，將熒光標(biāo)記的待測(cè)蛋白樣本結(jié)合到蛋白芯片上，通過(guò)蛋白-蛋白間相互作用形成結(jié)合，然后對(duì)芯片進(jìn)行激光掃描，從而對(duì)不同樣本的特定蛋白含量進(jìn)行半定量分析比較和分析。第一個(gè)以抗體構(gòu)建的蛋白芯片于1983年發(fā)表，并獲得美國(guó)專利us4591570。技術(shù)上來(lái)講，蛋白芯片來(lái)源于dna芯片技術(shù)，但卻克服了后者因所測(cè)的mrna等核酸表達(dá)不能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)改變的缺陷。正常細(xì)胞的生理功能或腫瘤細(xì)胞的異常表型，是通過(guò)蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，除了獲得細(xì)胞蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量，蛋白芯片還能對(duì)蛋白翻譯后的修飾狀態(tài)，如磷酸化、泛素化等改變進(jìn)行分析，而這些蛋白表觀修飾的異常，往往是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。除了相較于基因芯片的優(yōu)勢(shì)，蛋白芯片也解決了傳統(tǒng)的基于電泳的免疫印跡技術(shù)和基于分子物理化學(xué)特性的層析色譜法耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度低等缺點(diǎn)?；熕幬锬退幮允悄[瘤治療面臨的一大難題。惡性膠質(zhì)瘤，特別是whoiv級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gbm)的標(biāo)準(zhǔn)治療包括最大范圍的手術(shù)切除和術(shù)后的放化聯(lián)合治療，然而gbm卻常因?yàn)閷?duì)化療藥物的抵抗而出現(xiàn)復(fù)發(fā)和進(jìn)展。生物微陣列芯片技術(shù)的發(fā)展，為從基因組范圍內(nèi)研究膠質(zhì)瘤的耐藥相關(guān)表達(dá)譜提供了強(qiáng)有力的工具。生物芯片研究理念認(rèn)為多數(shù)膠質(zhì)瘤具有分子異質(zhì)性，利用分子生物學(xué)手段對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分子分型和預(yù)后判斷更能準(zhǔn)確反映膠質(zhì)瘤內(nèi)在的病理生理機(jī)制，可以更為客觀且準(zhǔn)確地闡明腫瘤對(duì)化療敏感性和預(yù)后評(píng)判之間的關(guān)系。化療抵抗在機(jī)制上可以分為內(nèi)在性和外在(獲得)性兩類，前者指腫瘤細(xì)胞在受到化療之初變本身具備的遺傳特性，比如高表達(dá)o6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mgmt)的膠質(zhì)瘤便可因?yàn)閷?duì)替莫唑胺(tmz)的遺傳毒性的修復(fù)耐受而產(chǎn)生耐藥。而獲得性耐藥機(jī)制則是腫瘤細(xì)胞在受到藥物毒性作用的過(guò)程中，逐漸產(chǎn)生的一系列基因突變、表觀修飾、蛋白分子改變從而獲得耐藥表型，包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡改變、dna損傷修復(fù)機(jī)制等相關(guān)的基因表達(dá)改變。相對(duì)于內(nèi)在耐藥性，獲得性耐藥在臨床上更為常見(jiàn)，因?yàn)楹芏嗄z質(zhì)瘤患者在化療之始可以表現(xiàn)出對(duì)藥物的反應(yīng)，但在幾個(gè)周期的治療周期后反應(yīng)性大為減低乃至出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。因而研究膠質(zhì)瘤獲得性耐藥的分子機(jī)制從而尋找治療靶標(biāo)對(duì)提高惡性膠質(zhì)瘤的治療水平具有重要意義。替莫唑胺(tmz)屬于第二代烷化劑，因具有較高的血腦屏障(bbb)透過(guò)率能夠在腦腫瘤組織中形成較高濃度，其細(xì)胞毒作用主要是通過(guò)瘤細(xì)胞dna鳥(niǎo)苷酸o6位點(diǎn)甲基化，引起復(fù)制時(shí)發(fā)生g-t錯(cuò)配從而造成dna損傷和細(xì)胞凋亡。替莫唑胺是目前膠質(zhì)瘤治療的一線化療藥物，研究膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的化療耐藥機(jī)制，對(duì)增強(qiáng)其細(xì)胞毒性作用增加治療敏感性具有重要意義。目前對(duì)腫瘤耐藥分子機(jī)制的研究主要是通過(guò)基因芯片檢測(cè)具有不同化療敏感性的腫瘤樣本，這種研究手段有兩種局限性，第一個(gè)方面，所制作的基因芯片往往是包含全基因組信息，檢測(cè)到的差異基因一般是參與了多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)過(guò)程，但是這些生物功能和通路并不一定與腫瘤細(xì)胞對(duì)特定化療的反應(yīng)性有關(guān)，基于這些興趣基因的表達(dá)和功能研究對(duì)膠質(zhì)瘤化療反應(yīng)的預(yù)后判斷以及特異的化療增敏性改進(jìn)也許并無(wú)較大意義。再者，就算這些差異基因確實(shí)參與了腫瘤對(duì)某種化療藥物的耐藥，由于臨床標(biāo)本的獲取上并無(wú)法區(qū)分此種導(dǎo)致耐藥性的差異是由于腫瘤細(xì)胞遺傳本身具有，還是在化療過(guò)程中繼發(fā)獲得的，這也導(dǎo)致所得到的興趣基因并不能真正反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的化療抵抗策略。第二個(gè)方面，基因芯片是基于cdna等核酸分子構(gòu)建的生物微陣列檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)對(duì)象是dna、mrna等所反應(yīng)的細(xì)胞遺傳、轉(zhuǎn)錄信息，而真正體現(xiàn)細(xì)胞組織生物學(xué)功能的是蛋白質(zhì)，很多情況下，細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組的改變與蛋白組的改變并不一致，這也約束了以基因芯片為基礎(chǔ)的表達(dá)譜檢測(cè)在腫瘤耐藥分子機(jī)制研究中的顯著性。此外，由于對(duì)腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥機(jī)制的研究受到臨床樣本獲取困難的限制，既往的研究主要是在體外通過(guò)對(duì)穩(wěn)定傳代的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行不同濃度的持續(xù)藥物作用，從而獲得耐受藥物的細(xì)胞克隆，并在此耐藥細(xì)胞的模型上進(jìn)行基因和分子特征的鑒定，所采取的分析手段除了前述的基因芯片以外，還有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、免疫印跡法(westernblotting)用于檢測(cè)耐藥細(xì)胞的分子改變。這樣的研究手段可以得到腫瘤獲得性耐藥的模型，但是后續(xù)的分子特征譜的分析仍不能脫離基因芯片的局限性和常規(guī)蛋白測(cè)定的低效率和低敏感度等缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明一方面提供了一種化療藥物相關(guān)分子特異性蛋白芯片，另一方面提供了該蛋白芯片的制備方法及其在檢測(cè)分析腫瘤獲得性耐藥相關(guān)分子中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明在第一方面提供了一種化療藥物相關(guān)分子特異性蛋白芯片，該蛋白芯片上固定的是針對(duì)腫瘤耐藥基因制備的抗體，該腫瘤耐藥基因是由和該化療藥物的反應(yīng)性、細(xì)胞毒性相關(guān)的分子所參與的細(xì)胞信號(hào)通路信息與該腫瘤接受化療后生存期相關(guān)的差異基因進(jìn)行重疊而獲得。在本發(fā)明一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，上述腫瘤為膠質(zhì)瘤。優(yōu)選地，上述化療藥物選自司莫司汀(ccnu)、卡莫司汀(bcun)和替莫唑胺(tmz)中的一種或幾種。更進(jìn)一步地，上述化療藥物為替莫唑胺。本發(fā)明在第二方面提供了一種化療藥物相關(guān)分子特異性蛋白芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟1、將和上述化療藥物的反應(yīng)性、細(xì)胞毒性相關(guān)的分子所參與的細(xì)胞信號(hào)通路信息與上述腫瘤接受化療后生存期相關(guān)的差異基因進(jìn)行重疊，篩選出感興趣的腫瘤耐藥基因；步驟2、針對(duì)步驟1中獲得的腫瘤耐藥基因制備人源單克隆抗體；步驟3、將步驟2中制備的人源單克隆抗體固定在涂有小牛血清蛋白和多聚支持物的載玻片上，制得蛋白芯片；步驟4、將步驟3中制得的蛋白芯片浸泡于小牛血清蛋白緩沖液，以消除非特異結(jié)合。在本發(fā)明一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，上述腫瘤為膠質(zhì)瘤。優(yōu)選地，上述化療藥物為替莫唑胺。本發(fā)明在第三方面提供了上述化療藥物相關(guān)分子特異性蛋白芯片在檢測(cè)分析腫瘤獲得性耐藥相關(guān)分子中的應(yīng)用，包括以下步驟：步驟1、用上述化療藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)腫瘤耐藥細(xì)胞株，另設(shè)立親本腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照組；步驟2、對(duì)上述腫瘤耐藥細(xì)胞株和上述親本腫瘤細(xì)胞進(jìn)行蛋白檢測(cè)，包括蛋白質(zhì)抽提和標(biāo)記、芯片雜交和掃描芯片獲得差異蛋白；步驟3、生物信息分析。在本發(fā)明一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，當(dāng)化療藥物為替莫唑胺時(shí)，替莫唑胺相關(guān)分子特異性蛋白芯片在檢測(cè)分析腫瘤獲得性耐藥相關(guān)分子中的應(yīng)用包括以下步驟：步驟1、用替莫唑胺誘導(dǎo)培養(yǎng)腫瘤耐替莫唑胺細(xì)胞株，另設(shè)立親本腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照組；步驟2、對(duì)上述腫瘤耐替莫唑胺細(xì)胞株和上述親本腫瘤細(xì)胞進(jìn)行蛋白檢測(cè)，包括蛋白質(zhì)抽提和標(biāo)記、芯片雜交和掃描芯片獲得差異蛋白；步驟3、生物信息分析。在一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，上述腫瘤為膠質(zhì)瘤，培養(yǎng)的細(xì)胞為膠質(zhì)瘤u251細(xì)胞。本發(fā)明主要解決了以下問(wèn)題：1、采用蛋白芯片進(jìn)行腫瘤尤其是膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制分析，使得獲取的分子和通路較之基因?qū)用娓唢@著功能意義，在后期驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所挑選陰性分子經(jīng)pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rna水平具有顯著差異，表明該分子在翻譯水平經(jīng)過(guò)了某種修飾使得最終表達(dá)水平在耐藥株和親本株之間持平，因此本發(fā)明檢測(cè)的耐藥機(jī)制證據(jù)性更強(qiáng)；2、采用蛋白芯片研究耐藥機(jī)制，較之傳統(tǒng)免疫印跡法等檢測(cè)技術(shù)效率更快，敏感性更高，用免疫印跡法(westernblotting)對(duì)部分芯片差異分子進(jìn)行驗(yàn)證，所得結(jié)果與芯片結(jié)果相比蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)減少，表明本發(fā)明的檢測(cè)效能更高；3、采用經(jīng)前期腫瘤耐藥研究所得到的基因信息，結(jié)合最新化療敏感性相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，構(gòu)建全面、針對(duì)性的蛋白抗體微陣列，較之既往蛋白芯片集中于繁雜的機(jī)制和通路研究，本發(fā)明更具特異性，更能夠獲得與化療耐藥密切相關(guān)的研究成果；4、本發(fā)明一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中的檢測(cè)對(duì)象是經(jīng)替莫唑胺誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株和它的不耐藥的親本株，兩個(gè)樣本的分子表達(dá)差異代表了腫瘤細(xì)胞的多藥耐受(mdr)表型差異，此種檢測(cè)模型更接近臨床膠質(zhì)瘤化療的耐藥模式，所闡明的分子機(jī)制是在關(guān)系腫瘤化療的分子機(jī)制中更為重要的獲得性耐藥的機(jī)制；5、本發(fā)明對(duì)蛋白芯片檢測(cè)所得的差異分子進(jìn)行逐步生物信息分析，通過(guò)分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行直觀顯示，可以在網(wǎng)絡(luò)圖中顯示某特定通路(如凋亡、dna修復(fù)、細(xì)胞干性)的調(diào)控信息。以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。附圖說(shuō)明圖1示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中蛋白芯片檢測(cè)待測(cè)蛋白分子的流程示意圖；圖2示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中蛋白芯片與提取自耐藥株(實(shí)驗(yàn)組)和親本株(對(duì)照組)u251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的蛋白雜交后的芯片掃描圖像；圖3示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的生物信息分析結(jié)果；其中圖3a示出了差異基因參與的go分類的p值，并以–log10(p值)作為該分子的富集值；圖3b示出了差異蛋白分子對(duì)應(yīng)基因的信號(hào)通路，計(jì)算每條信號(hào)通路的p值，以–log10(p值)作為該分子的富集值；圖4示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的替莫唑胺耐藥相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖。具體實(shí)施方式下面以構(gòu)建針對(duì)替莫唑胺化療敏感性的蛋白芯片檢測(cè)惡性膠質(zhì)瘤獲得性耐藥相關(guān)分子為例，詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書(shū)限制。構(gòu)建烷化劑相關(guān)分子特異性蛋白芯片1、回顧分析本發(fā)明人前期通過(guò)對(duì)腫瘤全切除后接受司莫司汀(ccnu)化療的4名gbm患者的腫瘤標(biāo)本制作的含有54000個(gè)核酸探針的affymetrixoligomicroarrayu1332.0基因芯片，芯片按4名患者生存期長(zhǎng)短分為兩組，對(duì)兩組芯片進(jìn)行檢測(cè)后經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(隨機(jī)方差模型t檢驗(yàn)，fdr<0.05，p<0.01)得到總共2018條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的基因，其中934條基因上調(diào)，1084條基因下調(diào)(zhaoz,liuy,heh,chenx,chenj,luyc.candidategenesinfluencingsensitivityandresistanceofhumanglioblastomatosemustine.brainresbull.2011oct10；86(3-4):189-94.)。2、在這2018條基因的基礎(chǔ)上，通過(guò)ncbipubmed文獻(xiàn)查詢(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed，檢索式"semustine"[meshterms]or"temozolomide"[supplementaryconcept]and"neoplasms"[meshterms])，尋找與以司莫司汀、替莫唑胺等一線膠質(zhì)瘤化療藥物為代表的烷化劑反應(yīng)性、細(xì)胞毒性相關(guān)的分子，然后在kegg(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取這些分子參與的細(xì)胞信號(hào)通路信息，再與gbm生存期相關(guān)的差異基因進(jìn)行重疊，得到1358條本發(fā)明中的興趣基因。3、針對(duì)1358條篩選出的膠質(zhì)瘤耐藥基因制備人源單克隆抗體，然后用高精密度機(jī)械手的針狀點(diǎn)樣槍頭在涂有小牛血清蛋白(bsa)以及多聚支持物的載玻片上固定抗體，點(diǎn)樣后再將芯片置于溫浴中3小時(shí)并浸泡于小牛血清蛋白緩沖液以消除非特異結(jié)合，芯片上每個(gè)用于檢測(cè)的抗體重復(fù)點(diǎn)樣三次，另單獨(dú)點(diǎn)樣gapdh、actin作為內(nèi)參，在芯片邊緣點(diǎn)樣cy3標(biāo)記抗體作為陽(yáng)性內(nèi)參，陰性對(duì)照為bsa，空白對(duì)照不含任何成分并作為芯片背景信號(hào)?？偣矘?gòu)建兩張完全一樣的蛋白芯片，分別用于耐藥株和親本株樣本的檢測(cè)。誘導(dǎo)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤u251耐替莫唑胺細(xì)胞株1、替莫唑胺藥物的配制室溫下，電子天平稱取50mg替莫唑胺粉末，溶于4mldmso中，每隔5分鐘搖動(dòng)約30秒鐘，觀察藥物溶解情況，直至藥物完全溶解，過(guò)濾后室溫棕色小瓶避光放置待用。替莫唑胺母液濃度為12.5mg/ml。2、替莫唑胺濃度的確定參照以往文獻(xiàn)和正式誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)前所做的藥物預(yù)實(shí)驗(yàn)從而確定最佳誘導(dǎo)藥物替莫唑胺的作用濃度，起始最低濃度為1μg/ml，之后倍增濃度2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml直至最高濃度64μg/ml。3、細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程本實(shí)施例中采用間斷倍增替莫唑胺藥物濃度的方法來(lái)誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株。u251細(xì)胞培養(yǎng)基中替莫唑胺的初始濃度為1μg/ml，每當(dāng)u251細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，就開(kāi)始增加逐漸倍增培養(yǎng)基中的替莫唑胺的藥物濃度以使大部分腫瘤細(xì)胞死亡而存活的u251細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)。如此反復(fù)藥物倍增誘導(dǎo)連續(xù)體外培養(yǎng)5個(gè)月以后，使耐藥細(xì)胞培養(yǎng)基中替莫唑胺的最終濃度為64μg/ml，將這時(shí)的替莫唑胺膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株命名為u251/tmz，另設(shè)立親本的u251細(xì)胞為對(duì)照組。蛋白檢測(cè)1、樣品蛋白質(zhì)抽提和標(biāo)記a、蛋白質(zhì)抽提1)、收集耐藥株(實(shí)驗(yàn)組)和親本株(對(duì)照組)u251膠質(zhì)瘤細(xì)胞。2)、使用渦旋器高速震蕩1min，隨后冰上靜置10min，重復(fù)3-5次(此步驟在1小時(shí)內(nèi)完成)。4℃，10,000xg(14000rpm)離心15min，吸上清于一新離心管中，重復(fù)離心4-6次。3)、最后一次離心，將上清移入一個(gè)干凈的試管中，進(jìn)行下一步驟實(shí)驗(yàn)或者-80℃儲(chǔ)存。b、蛋白濃度測(cè)定使用bca試劑盒測(cè)定蛋白濃度。c、蛋白質(zhì)標(biāo)記1)、使用前將生物素試劑(biotinreagent)簡(jiǎn)單離心，每1mg生物素試劑加入100uldmf，終濃度為10ug/ul，標(biāo)記為biotin/dmf。2)、每個(gè)樣本各取50ug蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)記，每管加入3ul生物素/dmf，終體積75ul；室溫混合均勻，室溫下震蕩反應(yīng)2h。3)、加入35ul中止液，室溫下震蕩反應(yīng)30min。4)、將樣品儲(chǔ)存在-80℃或進(jìn)行下一步驟。no.樣本名稱濃度(g/l)體積(μl)總量(μg)1u251/tmz2.451002452u2512.21100221表1蛋白抽提信息2、芯片雜交a.芯片封閉1)、將蛋白芯片從冰箱取出，室溫平衡45min。2)、在100x15mm培養(yǎng)皿中加入30ml封閉溶液，將蛋白芯片完全浸沒(méi)。確定芯片表面與條碼向上，將培養(yǎng)皿放到搖床上，室溫55rpm封閉45min。3)、使用milli-q水按照下面步驟全面洗滌：a)、將芯片放入50ml圓形離心管，加入45mlmilli-q，蓋緊蓋子；b)、用手上下顛倒或者震搖管子10s，倒掉milli-q；c)、離心管中換入新的milli-q，震搖管子10s，倒掉milli-q；d)、重復(fù)10次。4)、甩掉芯片表面的多余milli-q水，馬上進(jìn)入下一步反應(yīng)。b、目標(biāo)蛋白與抗體雜交1)、在一個(gè)試管中，加入6ml偶聯(lián)溶液(couplingsolution)，加入生物素標(biāo)記的蛋白(50ug)簡(jiǎn)單混合均勻，標(biāo)記為蛋白偶聯(lián)混合物(proteincouplingmix)。2)、將芯片放入干凈的培養(yǎng)皿，芯片表面向上，緩慢的將6ml蛋白偶聯(lián)混合物(proteincouplingmix)加到芯片表面。將芯片完全浸沒(méi)，蓋上偶聯(lián)腔(couplingchamber)；室溫在搖床上以35rpm反應(yīng)2h。3)、將芯片移到一個(gè)盛有30ml1x清洗溶液(washsolution)的100x15mm培養(yǎng)皿中，室溫在搖床上以55rpm反應(yīng)10min，倒掉洗液，重復(fù)此步3次。4)、使用milli-q水按照下面步驟全面洗滌：a)、將芯片放入50ml圓形離心管，加入45mlmilli-q，蓋緊蓋子；b)、用手上下顛倒或者震搖管子10s，倒掉milli-q；c)、離心管中換入新的milli-q，震搖管子10s，倒掉milli-q；d)、重復(fù)10次；5)、甩掉芯片表面的多余milli-q水，馬上進(jìn)入下一步反應(yīng)。c、信號(hào)檢測(cè)1)、向60ml檢測(cè)緩沖液(detectionbuffer)中加入60mlcy3-鏈霉親和素(0.5mg/ml)。2)、在一個(gè)100x15mm培養(yǎng)皿中加入30mlcy3-鏈霉親和素。3)、將芯片沒(méi)入cy3-鏈霉親和素溶液。室溫避光，在搖床上55rpm反應(yīng)20min。4)、將芯片移入一個(gè)新的盛有30ml1x清洗溶液(washsolution)的100x15mm培養(yǎng)皿中；室溫在搖床上55rpm反應(yīng)10min。重復(fù)此步驟3次。5)、使用milli-q水按照下面步驟全面洗滌：a)、將芯片放入50ml圓形離心管，加入45mlmilli-q，蓋緊蓋子；b)、用手上下顛倒或者震搖管子10s，倒掉milli-q；c)、離心管中換入新的milli-q，震搖管子10s，倒掉milli-q；d)、重復(fù)10次。6)、離心干燥芯片表面。7)、掃描芯片。名稱廠家4度離心機(jī)fresco17賽默飛世爾(thermoscientific)，美國(guó)常溫離心機(jī)pico21賽默飛世爾(thermoscientific)，美國(guó)酶標(biāo)儀pevictor珀金埃爾默(perkinelmer)，美國(guó)渦旋振蕩器vortex5其林貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器，中國(guó)搖床ts-2其林貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器,中國(guó)芯片小型離心機(jī)chipmatepmc－082湯米(tomy)，日本芯片小型離心機(jī)chipmatepmc－082上海天能芯片掃描儀genepix4000b阿克森儀器(axoninstruments)，美國(guó)表2芯片實(shí)驗(yàn)儀器3、掃描芯片獲得差異蛋白1)、雜交后的芯片使用genepix4000b掃描儀進(jìn)行，掃描獲得的結(jié)果見(jiàn)圖2。2)、對(duì)掃描獲取的芯片圖像，使用genepixpro6.0軟件(axoninstruments，usa)讀取原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組兩張芯片上每種抗體兩次重復(fù)，首先計(jì)算兩次重復(fù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差sd以及變異系數(shù)cv。對(duì)于兩個(gè)樣本間差異蛋白的篩選，選擇內(nèi)參中信號(hào)相對(duì)穩(wěn)定的并且此信號(hào)在兩組樣本間比值接近1。根據(jù)以上原則，選用gapdh作為內(nèi)參，故蛋白表達(dá)比值為每個(gè)抗體的平均值與gapdh的比值。樣品名稱背景信號(hào)陽(yáng)性內(nèi)參信號(hào)beta-actingapdhu251/tmz810.53500.0654.0673.0u251973.06228.5943.0808.5表3芯片內(nèi)參數(shù)據(jù)3)、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異蛋白計(jì)算公式：(以差異倍數(shù)≧1.50為顯著上調(diào)蛋白，≦0.50為顯著下調(diào)蛋白)生物信息分析1、geneontology(go)分析：本發(fā)明利用geneontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)和在線查詢工具david(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進(jìn)行差異蛋白對(duì)應(yīng)基因的功能注釋和富集分析，采用雙尾fisher's精確檢驗(yàn)得到所查詢到的差異基因參與的go分類的p值，并以–log10(p值)作為該分子的富集值，如圖3a所示。matlab(http://www.mathworks.com)以及mysql(http://www.mysql.com/)為計(jì)算平臺(tái)。2、耐藥通路分析：基于kegg(http://www.genome.jp/kegg/)andncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢差異蛋白分子對(duì)應(yīng)基因的信號(hào)通路，計(jì)算每條信號(hào)通路的p值，以–log10(p值)作為該分子的富集值，如圖3b所示，同樣以matlab(http://www.mathworks.com)以及mysql(http://www.mysql.com/)為計(jì)算平臺(tái)。3、耐藥相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖：查詢humanproteinreference數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hprd.org/)，利用蛋白芯片篩選出的200條顯著差異分子的相互調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建替莫唑胺耐藥相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖，每個(gè)節(jié)點(diǎn)面積大小代表差異水平，顏色代表上調(diào)或者下調(diào)，線條樣式代表調(diào)控關(guān)系，如圖4所示。本實(shí)施例在既有的高通量生物微陣列技術(shù)和膠質(zhì)瘤基因譜特征的基礎(chǔ)上，構(gòu)建特異性針對(duì)替莫唑胺化療藥物敏感性的蛋白芯片，對(duì)體外誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)并通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找化療反應(yīng)性密切相關(guān)的差異基因和分子，從而深入了解膠質(zhì)瘤獲得性耐藥的機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥靶點(diǎn)的分子靶向治療，提高惡性膠質(zhì)瘤的總體治療水平。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本
技術(shù)領(lǐng)域：
中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12