本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)檢測方法及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明涉及一種利用質(zhì)譜技術(shù)通過檢測特征多肽檢測脫細胞基質(zhì)材料中纖維連接蛋白含量的方法。

技術(shù)背景

小腸粘膜下層基質(zhì)(smallintestinalsubmucosa，sis)材料是指小腸粘膜下層經(jīng)脫細胞等方法處理后去除免疫原性物質(zhì)后的所得到的生物材料，廣泛用于各種軟組織缺損的修復，具有誘導細胞粘附生長、促進組織再生和重建等功能。sis材料作為外科植入物已成功用于神經(jīng)、腹壁、硬腦膜、肌腱、泌尿道、鼓膜等組織缺損的修復，具有安全有效、術(shù)后并發(fā)癥少、感染率低、患者滿意度高等優(yōu)點，證實了sis材料是一種理想的用于組織缺損修復和重建的無免疫排斥的動物源性植入材料。

sis基質(zhì)材料作為一種脫細胞基質(zhì)主要成分為膠原蛋白，并包含非膠原類的結(jié)構(gòu)蛋白和生物粘多糖。其中膠原蛋白主要由i型和iii型組成，非膠原類蛋白主要包括纖維連接蛋白(fibronectin，fn)、層粘連蛋白和生長因子等。fn是一種糖蛋白，由兩個分子量為220kda的亞基以二硫鍵連接的二聚體形式存在，主要由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和肌細胞等合成分泌，分為血漿型和組織型。通過比較不同物種的fn基因核苷酸序列，結(jié)果顯示fn基因是高度保守的。不同物種不同組織來源的fn，其分子量、基本空間結(jié)構(gòu)及生物學性質(zhì)均基本一致。fn作為主要的細胞粘附分子其主要功能是介導細胞粘著、促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏合和增強巨噬細胞的內(nèi)吞作用，在胚胎生成、傷口愈合和止血等許多重要的生理過程中起著關(guān)鍵性作用，fn的異常表達和降解過程與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。sis中所含有的fn對細胞在sis表面的粘附與遷移有很大的影響。但是，目前還沒有高效、穩(wěn)定、精確的生物材料中組織型fn的檢測方法。

目前已有的fn測定方法包括酶聯(lián)免疫法(elisa)、放射免疫法、免疫透射比濁法、單向火箭電泳法、化學發(fā)光法、免疫組化法、速率散射比濁法、microbca方法等。其中應(yīng)用最為普遍的是elisa法，在elisa法中首先將fn作為抗原與抗體結(jié)合，再經(jīng)化學顯色反應(yīng)，通過檢測顯色底物的吸光度值確定fn的含量，但該方法主要用于血漿型fn的檢測。sis中的fn屬于組織型并結(jié)合形式存在，直接采用elisa方法則抗體難以直接與fn結(jié)合，非特異性吸附也會影響結(jié)果的準確度，導致檢測結(jié)果與實際含量存在較大偏差。

此外，雖然基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)檢測方法用于低豐度蛋白的定量分析具有靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，可根據(jù)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物中的多肽豐度進行無標記定量檢測。但是，作為脫細胞基質(zhì)成分fn的在脫細胞基質(zhì)中含量很少，此外由于脫細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)使得序列特異性酶難以直接降解這些fn。因此，無法完全酶解脫細胞基質(zhì)中的fn?？梢娂词公@得一些肽段，也無法作為準確檢測fn含量的基礎(chǔ)，也就無法使用質(zhì)譜法定量測量fn在脫細胞基質(zhì)中的準確含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對脫細胞基質(zhì)中fn檢測存在的問題，本發(fā)明提供一種基于酶解和質(zhì)譜分析的纖維連接蛋白的定量檢測方法，從而克服上述問題以準確地檢測纖維連接蛋白在脫細胞基質(zhì)中的含量。

一種檢測脫細胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量的方法，其特征在于，該檢測方法包括以下步驟：(1)預處理：稱取一定重量的脫細胞基質(zhì)，將其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保護條件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50-300μm；(2)酶解1：取一定量粉碎后脫細胞基質(zhì)粉末，加入到脫細胞基質(zhì)粉末重量500-10000倍的緩沖液，在100℃熱處理5-10min，冷卻后加入脫細胞基質(zhì)重量1/200～1/50的膠原酶，于37℃振蕩處理2-24h；(3)酶解2：將步驟(2)獲得的溶液ph調(diào)節(jié)至7.5-8.5，加入非膠原類蛋白酶，非膠原類蛋白酶的加入量為脫細胞基質(zhì)重量的1/200～1/50，于37℃反應(yīng)8-24h；(4)質(zhì)譜檢測：將步驟(3)獲得的酶解溶液進行濃縮，濃縮液直接進行質(zhì)譜分析，以已知濃度的纖維連接蛋白標準品溶液的酶解產(chǎn)物為對照，檢測特征多肽，通過測定脫細胞基質(zhì)降解產(chǎn)物中纖維連接蛋白特征多肽計算脫細胞基質(zhì)中纖維連接蛋白的含量。

所述步驟(2)酶解過程中使用的膠原酶可以是i型、ii型、iii型、v型或不同類型膠原酶的混合物，加入量是脫細胞基質(zhì)重量的1/200～1/50。

所述步驟(3)酶解過程中使用的蛋白酶可以是胰蛋白酶、化學修飾后的胰蛋白酶或固定化的胰蛋白酶，加入量是脫細胞基質(zhì)重量的1/200～1/50。

所述步驟(4)中用于檢測脫細胞基質(zhì)中纖維連接蛋白的特征多肽包括：ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr中的一種或多種。

本發(fā)明還提供一種纖維連接蛋白的特征多肽，其特征在于，所述纖維連接蛋白經(jīng)過如前述的步驟(1)、(2)和(3)能夠得到所述特征多肽，所述特征多肽能夠用于檢測所述纖維連接蛋白的含量；所述特征多肽為前述的特征多肽：ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr。

提供一種纖維連接蛋白的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法使用如所述的特征多肽。

提供一種用于檢測纖維連接蛋白的試劑盒，其特征在于，包括一種或多種酶；所述一種或多種酶能夠酶解纖維連接蛋白，并產(chǎn)生如前述的特征多肽。

試劑盒還包括纖維連接蛋白標準品或前述的所述特征多肽的標準品。

所述一種或多種酶包括：膠原酶和蛋白酶；所述膠原酶優(yōu)選i型、ii型、iii型或v型膠原酶；所述蛋白酶優(yōu)選胰蛋白酶、化學修飾后的胰蛋白酶或固定化的胰蛋白酶。

還提供一種所述的特征多肽的在檢測纖維連接蛋白中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1靜態(tài)酶解和分批次酶解過程中sis殘留量的動態(tài)變化

圖2為纖維連接蛋白酶解多肽的總離子流圖；

圖3為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；

圖4為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的二級質(zhì)譜圖；

圖5不同濃度的纖維連接蛋白特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖；

圖6纖維連接蛋白標準品濃度與信號強度關(guān)系曲線；

圖7和圖8分別為特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；

圖9和圖10分別為特征多肽ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；

圖11和圖12分別為特征多肽flattpnsllvswqppr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；

圖13和圖14分別為特征多肽paqgvvttlenvsppr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；

圖15和圖16分別為特征多肽dtltsr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖。

上述附圖用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明，而并非用于限定本發(fā)明的技術(shù)方案。

具體實施方式

本發(fā)明首先根據(jù)質(zhì)譜分析確定的纖維連接蛋白的特征多肽并使用纖維連接蛋白標準物建立濃度與質(zhì)譜峰面積之間的線性關(guān)系，然后采用質(zhì)譜法檢測待測樣品中特征多肽的峰值并根據(jù)濃度與質(zhì)譜峰面積之間的關(guān)系確定小腸粘膜下層基質(zhì)中纖維連接蛋白的含量。下文將通過具體的實施方式加以說明。

待測物分別為經(jīng)免疫原去除處理的豬的小腸粘膜下層基質(zhì)；所述使用的ⅰ型膠原酶(分析純)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(序列純)購自美國promega公司；fibronectin購自美國calbiochem公司。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(hplc-ms)由美國agilent公司1100液相色譜和美國thermofisher公司lcqdeca^xp電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為xcalibur1.3；液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由美國thermofisher公司u3000液相和tsqquantumaccessmax質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為xcalibur1.3。

1、小腸粘膜下層基質(zhì)降解實驗

靜態(tài)酶解：稱取100mg小腸粘膜下層基質(zhì)，加入100ml緩沖液(50mmtris-hcl，0.36mmcacl2，ph7.4)，在100℃熱變性處理10min，降至常溫后加入1ml的膠原酶溶液(1mg/mlhank's平衡鹽溶液(hbss)緩沖液)，37℃水浴震蕩至無可見固形物，離心后收集上清液。

分批次酶解：稱取100mg小腸粘膜下層基質(zhì)，加入8ml緩沖液(50mmtris-hcl，0.36mmcacl2，ph7.4)，100℃熱變性處理10min，降至常溫后加入200μl的膠原酶溶液(1mg/mlhbss緩沖液)，37℃酶解1h，10000rpm離心3min，取出上清液，沉淀加入200μl膠原酶溶液和8ml緩沖液，繼續(xù)37℃酶解1小時，重復上述過程5次，合并上清液。

2、胰蛋白酶酶解實驗

將小腸粘膜下層基質(zhì)的膠原酶降解產(chǎn)物冷凍干燥，使用50mmnh4hco3溶液(ph8.0)配置成1mg/ml的溶液，加入20μl的胰蛋白酶溶液(1mg/ml，50mmnh4hco3，ph8.0)，37℃酶解12h，酶解產(chǎn)物直接進行hplc-ms檢測。

3、氨基酸組成分析

小腸粘膜下層基質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的水解方法參照文獻“海參體壁酸溶性膠原提取及氨基酸組成分析”(高楊，董秀萍，肖桂華，江慧敏，朱蓓薇，《食品與發(fā)酵工業(yè)》,2008,34(11):171-174)中記載的方法。

氨基酸組成分析：色譜柱為zorbaxc18[150mm×3.0mm(i.d.)，5μm]；流動相a為0.05m乙酸鈉溶液，b為50％乙腈；梯度0～15min30～55％b，15～25min55～100％b，25～35min100～30％b，進樣量5μl；uv為360nm；流速1ml/min。

4、hplc-ms分析

色譜柱為zorbaxsbc18[150mm×2.1mm(i.d.)，5μm]；流動相a為水(含0.1％甲酸)，b為乙腈(含0.1％甲酸)；梯度0～80min，5％～50％乙腈；80～90min，50％～90％乙腈，進樣量50μl；uv為214nm和254nm；流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓4.5kv，毛細管溫度300℃，掃描范圍m/z957-958.精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級質(zhì)譜掃描(ms/ms)均為數(shù)據(jù)依賴型掃描，ms/ms碰撞能量為35％。

三重四極桿質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓3.5kv，毛細管溫度300℃，蒸發(fā)溫度：200℃，殼氣：35arb，輔助氣：8psi，掃描方式：選擇離子監(jiān)測：m/z957.5，掃描寬度：1.0。

采用靜態(tài)酶解法加入膠原酶后溶液中脫細胞基質(zhì)殘留量逐漸降低，酶解6h降解率達到40％，24h后降解率為60％，降解3天后仍有10％的脫細胞基質(zhì)未被降解，4天后殘留量趨于穩(wěn)定，溶液中殘留不能被降解的絮狀物，約5％(圖1)。氨基酸分析結(jié)果表明，殘留物主要成為天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸等氨基酸和一些非氨基酸成分，殘留物中幾乎未檢測出羥脯氨酸，表明脫細胞基質(zhì)中的膠原成分被有效降解。但是采用該方法降解脫細胞基質(zhì)的過程耗時長，且存在易染菌、酶失活以及隨機降解率高等不足。為了提高酶解效率，使用了分批次降解的方式，即降解一定時間后進行固液分離，沉淀物重新酶解。脫細胞基質(zhì)殘留量在前三次降解過程中變化較明顯，第一次換液時殘留量為70％，第二次換液時殘留量為50％，第三次換液時殘留量約為30％(圖1)，該過程重復五次后脫細胞基質(zhì)酶解較為完全。為了最大程度減少樣品中蛋白損失，實驗在分批次降解過程中降解次數(shù)延長至6次。

由于在fn上有與膠原蛋白高親和的結(jié)合點，因此采用膠原酶先將膠原蛋白酶解之后，再采用胰蛋白酶將fn酶解為多肽，用于確定纖維連接蛋白的特征多肽。

纖維連接蛋白經(jīng)序列純胰蛋白酶處理后產(chǎn)生大量低分子量多肽。符合定量檢測的多肽應(yīng)滿足一定條件：實驗首先對多肽進行blast多序列比對，只在纖維連接蛋白被檢出的肽段為纖維連接蛋白的特征多肽；酶解后的多肽質(zhì)譜信息用sequest軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索，當多肽帶1個電荷時實驗質(zhì)譜與理論質(zhì)譜的相關(guān)系數(shù)xcorr>1.5，帶2個電荷時xcorr>2.0，帶3個電荷時xcorr>2.5，同時deltacn>0.1，則所產(chǎn)生的肽段被認為是陽性結(jié)果；在hplc-ms分析的質(zhì)譜圖中提取特征多肽的離子流圖，可提取到低濃度樣品且其豐度較高，同時信噪比s/n>10，即適合作為特征多肽。

將胰蛋白酶酶解后的纖維連接蛋白用離子阱質(zhì)譜(lcq)進行全掃描分析，圖2為纖維連接蛋白酶解多肽的總離子流圖。將酶解后的多肽段進行blast多序列比對，結(jié)果表明纖維連接蛋白存在一定數(shù)量的特征多肽。以全部纖維連接蛋白為數(shù)據(jù)庫，將纖維連接蛋白降解后的多肽質(zhì)譜信息用bioworks軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索，篩選具有陽性結(jié)果的多肽段，根據(jù)blast多序列比對和bioworks軟件搜庫，確定纖維連接蛋白的特征多肽為ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr

圖3為多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖，圖4為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的二級質(zhì)譜圖。因此，可選擇多肽sspvvidastaidapsnlr作為特征多肽，用于纖維連接蛋白類型識別及定量檢測。取不同濃度經(jīng)變性酶解處理的纖維連接蛋白標準品溶液，從低濃度到高濃度依次進樣50μl，按hplc-ms定量檢測條件分析，監(jiān)測目標離子m/z＝957.5，得不同濃度纖維連接蛋白特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流，參見圖5，其中a、b、c、d、e中纖維連接蛋白的濃度分別為0.0024、0.0048、0.0096、0.0192、0.048mg/ml。以所選特征多肽提取離子流圖峰面積為縱坐標、纖維連接蛋白標準品濃度為橫坐標進行線性回歸，結(jié)果見圖6?；貧w方程為y＝4109.5x-12.82(r²＝0.995)，在0.0024～0.048g/l濃度范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

進一步確定脫細胞基質(zhì)中fn含量。稱取50mg脫細胞基質(zhì)加入膠原酶分5次酶解，合并5次酶解的上清液，冷凍干燥，得到123mg凍干物(含提取液里的鹽類物質(zhì))，取4mg凍干后的產(chǎn)物復溶，利用胰蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物按照hplc-ms定量檢測條件分析，按fn中特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子濃度為0.007mg/ml，經(jīng)計算得到脫細胞基質(zhì)中fn的含量為0.43％。

線性范圍：將同一樣品稀釋成不同的濃度，分別為2.4μg/ml、4.8μg/ml、9.6μg/ml、19.2μg/ml、48μg/ml、96μg/ml、192μg/ml，通過hplc-ms檢測其纖維連接蛋白含量，由濃度梯度和峰面積做曲線，確定峰面積呈線性的濃度的范圍。多次實驗結(jié)果表明，本方法在2.4μg/ml～192μg/ml之間成線性。

精密度：精確稱取fn標準品100μl，按定量hplc-ms條件進行分析，重復進樣五次，結(jié)果fn標準品中特征多肽sspvvidastaidapsnlr的峰面積相對偏差rsd為2.58％，結(jié)果表明方法精密度良好。

圖7和圖8分別為特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖。將einlapdsssvvvsglmvatk肽段作為特征多肽，通過以下方式檢測纖維連接蛋白含量：

(1)預處理：取200mg的脫細胞基質(zhì)，將其剪成尺寸約0.5cm×0.5cm的片狀，置于低溫粉碎機內(nèi)，加入液氮，粉碎溫度低于-100℃條件下粉碎，粉末粒徑控制值在100微米。

(2)酶解1：準確稱取100mg脫細胞基質(zhì)粉末，加入到8ml緩沖液中(50mm/ltris-hcl，0.36mmol/lcacl2，ph7.4)，加熱至100℃并保持10min，冷卻后加入2mg的膠原酶(含80％i型膠原酶和20％的iii型膠原酶)，在37℃振蕩處理1h，10000rpm離心3min，取出上清液，沉淀加入2mg膠原酶和8ml緩沖液，繼續(xù)37℃酶解1小時，重復上述過程5次，合并上清液。

(3)酶解2：使用0.05mol/l的naoh溶液將步驟(2)獲得的溶液ph調(diào)節(jié)至8.0，加入1mg胰蛋白酶，于37℃反應(yīng)16h。

(4)質(zhì)譜檢測：將步驟(3)獲得的酶解溶液進行氮吹法干燥，準確稱取1mg干燥后的粉末，溶解于1ml濃度為0.5mol/l的nh4hco3溶液，直接進行質(zhì)譜分析，檢測纖維鏈接蛋白酶解產(chǎn)物中的特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk對應(yīng)的帶雙電荷離子m/z1059，其峰面積為1.1×10⁵，以1mg/ml的fn標準品溶液的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物為對照并制作擬合曲線，質(zhì)譜法檢測特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk對應(yīng)的帶雙電荷離子m/z1059峰面積，測得細胞外基質(zhì)中纖維鏈接蛋白的含量為0.48％。

同理，參見附圖，其中圖9和圖10分別為特征多肽ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；圖11和圖12分別為特征多肽flattpnsllvswqppr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；圖13和圖14分別為特征多肽paqgvvttlenvsppr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖；圖15和圖16分別為特征多肽dtltsr的提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖。通過酶解纖維連接蛋白標準物針對上述特征多肽繪制濃度梯度和峰面積擬合曲線；對脫細胞基質(zhì)兩次酶解，質(zhì)譜法檢測上述特征多肽中一個或多個的濃度，從而準確測量脫細胞基質(zhì)中細胞連接蛋白的含量。

本發(fā)明通過二次酶解的方法實現(xiàn)了采用質(zhì)譜技術(shù)檢測脫細胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量的問題。此外進一步采用分批次酶解和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對脫細胞基質(zhì)材料中fn含量進行了定量檢測。針對sis的膠原酶酶解方案進行優(yōu)化，消除了時間長，效率低等弊端，將膠原酶酶解時間由96h降為6h，大大地提高了酶解效率。實驗中fn經(jīng)酶解得到多個特征肽段，可用于檢測纖維連接蛋白的含量。這種方法操作簡便，且適用于組織中fn的檢測。

此外，基于上述酶解方法，可以采用纖維連接蛋白標準物以及分步酶解所用的酶制作為試劑盒。將試劑盒與質(zhì)譜分析儀相結(jié)合以用于定量檢測待測脫細胞基質(zhì)纖維連接蛋白的含量。還可以直接采用上述特征多肽的標準物以及兩次酶解所用的酶作為試劑盒。將試劑盒與質(zhì)譜分析儀相結(jié)合以用于定量檢測待測脫細胞基質(zhì)纖維連接蛋白的含量。

本發(fā)明通過脫細胞基質(zhì)的預處理、分步酶解方法獲得纖維連接蛋白的所有多肽序列混合物，再篩選纖維連接蛋白中的特征多肽序列，通過質(zhì)譜法檢測特征多肽含量，從而測定出脫細胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量。該方法解決了以往無法使用質(zhì)譜法定量檢測脫細胞基質(zhì)中組織型纖維連接蛋白含量的問題；進一步地，通過分步酶解的方式去除脫細胞基質(zhì)中膠原蛋白成分、減少測試過程非目標蛋白多肽序列的干擾，從而節(jié)約了測試時間，提高工作效率、檢測精度和穩(wěn)定性。