本發(fā)明涉及高通量篩選領(lǐng)域，具體涉及一種基于串聯(lián)質(zhì)譜和分子對(duì)接聯(lián)用的活性多肽高通量篩選方法，為一種以串聯(lián)質(zhì)譜鑒定活性部位/成分群中混合多肽序列，利用分子對(duì)接篩選活性多肽并驗(yàn)證其活性的方法。

背景技術(shù)：

活性多肽是指由2～20個(gè)氨基酸殘基以酰胺鍵構(gòu)成，具有一定生理活性的物質(zhì)，通常分子量不高于2000da?，F(xiàn)代研究表明，活性多肽具有多種生理活性，而海洋來源的活性多肽具有來源豐富，活性顯著等特點(diǎn)，近年來受到廣泛關(guān)注。如從海洋生物中發(fā)現(xiàn)的活性肽類物質(zhì)，如dolastatin-10、芋螺毒素、魚皮降壓肽等，均表現(xiàn)出重要的市場(chǎng)價(jià)值與社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，越來越多科學(xué)家及科研團(tuán)隊(duì)將目光轉(zhuǎn)向海洋生物中活性多肽的尋找與開發(fā)。

傳統(tǒng)的海洋活性多肽的研究主要以活性導(dǎo)向下的系統(tǒng)分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定為主，該方法雖經(jīng)典，但存在耗時(shí)、費(fèi)力、通量低等缺點(diǎn)。海洋生物中的活性多肽因種類豐富、結(jié)構(gòu)特殊、含量低等特點(diǎn)，目前仍缺乏行之有效的分離、分析、篩選、鑒定解決方案，很難高通量的完成活性物質(zhì)的篩選與發(fā)現(xiàn)。

因此，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，研究開發(fā)出一種快速、高效尋找海洋活性多肽的方法，本發(fā)明集成lc-ms/ms快速鑒定混合多肽與計(jì)算機(jī)高效篩選優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)，可從海洋生物(或酶解產(chǎn)物)中快速尋找活性多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明要解決的問題在于：建立一種基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接的海洋活性多肽高通量篩選方法，這種方法既可用于海洋生物中自身存在的初級(jí)/次級(jí)代謝產(chǎn)物多肽的發(fā)現(xiàn)與篩選，亦可用于經(jīng)過生物酶處理后的混合多肽中活性多肽的發(fā)現(xiàn)與篩選，此外，該方法不局限于一種作用靶點(diǎn)的活性多肽的篩選，可應(yīng)用于多種已知的靶點(diǎn)的活性多肽的發(fā)現(xiàn)與篩選。

技術(shù)方案，為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接的活性多肽高通量篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)首先對(duì)海洋蛤類通進(jìn)行提取或生物酶酶解，然后分離制備得到總多肽提取物，然后在活性導(dǎo)向下進(jìn)行活性篩選，確定活性部位；

(2)然后通過lc-ms/ms對(duì)活性部位進(jìn)行質(zhì)譜分析，將得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過從頭測(cè)序分析(denovosequencing)和/或與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，快速確定蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列；

(3)然后通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選，將藥物作用靶點(diǎn)與活性物質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接，從而尋找受體與配體作用的最佳構(gòu)象，篩選出與受體親和力最佳的配體，完成高通量多肽的活性篩選，并通過固相合成多肽序列驗(yàn)證其活性。

以上所述的基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接的活性多肽高通量篩選方法，所述的分離方法包括分級(jí)沉淀、分子排阻、離子交換、反相柱層析、疏水層析等。

作為優(yōu)選海洋蛤類提取物的制備方法有：

將文蛤軟體洗凈泥沙，加水煎煮，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加水勻漿后，加入生物酶酶解，酶解結(jié)束后,于沸水浴滅活，離心，濃縮，得文蛤酶解物。

或者將文蛤軟體洗凈泥沙，加入3～8倍量60～80％乙醇煎煮1～3次，每次30～60分鐘，合并提取液，濃縮后，冷凍干燥，得凍干粉。

將文蛤提取物分離，獲得不同部位/成分群，并評(píng)價(jià)分離獲得的不同部位/成分群的活性，確定活性部位/成分群，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉備用。

其中生物酶包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等。

以上所述的基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接的活性多肽高通量篩選方法，所述的活性篩選的靶點(diǎn)包括：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)、二肽基肽酶-iv(dpp-iv)、凝血酶(thrombin)、乙酰膽堿酯酶(ache)等。

ace抑制劑活性評(píng)價(jià)方法：

ace與hhl溶液的配制：取適量ace用0.1mol/l含0.3mol/lnacl硼酸緩沖液(ph8.3)配成濃度為100mu/ml的ace溶液；取適量hhl用0.1mol/l硼酸緩沖液(含0.3mol/lnaclph8.3)配成濃度為5mmol/l的hhl溶液；

反應(yīng)過程：將30μlhhl和10μl樣品(或緩沖溶液)混勻后，于37℃環(huán)境下預(yù)熱5min(37℃水浴)，再加入20μl的ace啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后繼續(xù)于37℃環(huán)境下反應(yīng)1h(37℃水浴)，然后迅速加入70μlhcl(1mol/l)終止反應(yīng)，用高效液相色譜分析結(jié)果。用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對(duì)照。

色譜條件：sunfire-c18柱(2.1×100mm，3.5μm，美國(guó)waters公司)；流動(dòng)相：乙腈-0.5％甲酸水溶液，流速：0.5ml/min；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：220nm、254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。梯度洗脫條件：0～5min，2％乙腈；5～25min，2％～40％乙腈；25～30min，40％乙腈。

二肽基肽酶-4(dpp-iv)抑制活性評(píng)價(jià)方法：

采用比色法測(cè)定二肽基肽酶-4抑制肽的活性，具體步驟如下：取實(shí)施例1和實(shí)施例3分別制備得到的抑制肽溶于tris-hci緩沖液(含20mmol/ltris,ph8.0,0.1mol/lnacl，1mmol/ledta)制成相應(yīng)的樣品液。二肽基肽酶-4(dpp-4)、gly-pro-pna分別用tris-hcl緩沖液(含20mmol/ltris,ph8.0,0.1mol/lnacl，1mmol/ledta)配置成8u/l的dpp-4溶液和1.6mmol/l的gly-pro-pna(底物)溶液。將25μl樣品與25μl底物混勻，37℃孵育10min,再加入50μldpp-4溶液，在37℃孵育1小時(shí)，后加入1mol/l醋酸鈉緩沖液(ph4.0)100μl,405nm處測(cè)定吸光度值(a)，并計(jì)算抑制率。同時(shí)用tris-hci緩沖液代替樣品做空白對(duì)照。

dpp-4抑制率(％)＝[(a陰性對(duì)照-a空白對(duì)照)-(a樣品-a樣品空白)]/(a陰性對(duì)照-a空白對(duì)照)×100％

式中：a為吸光度值。

凝血酶抑制活性評(píng)價(jià)方法：

家兔頸總動(dòng)脈取血，3000rpm離心10min制備待測(cè)血漿。在測(cè)定杯中加入待測(cè)血漿40μl，37℃預(yù)溫3min后加入共同預(yù)溫一定時(shí)間的0.1mol/lph7.4tris-hcl緩沖液稀釋的15u/ml凝血酶溶液40μl和溶媒20μl。在加入凝血酶溶液的同時(shí)啟動(dòng)凝血因子分析儀記錄凝血時(shí)間(tt0)。tt延長(zhǎng)率(％)＝(tt-tt0)/tt0×100％。用不同濃度的凝血酶，測(cè)得凝血時(shí)間tt。計(jì)算tt延長(zhǎng)率(％)。以lgtt延長(zhǎng)率(％)對(duì)凝血酶濃度(c)作圖，得c對(duì)lgtt延長(zhǎng)率(％)的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在測(cè)定杯中加入待測(cè)血漿40μl，37℃預(yù)溫3min后，加入共同預(yù)溫3min的待測(cè)樣品20μl和15u/ml凝血酶40μl，記錄凝血時(shí)間(tt)，計(jì)算lgtt延長(zhǎng)率(％)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算凝血酶活力，以溶媒作對(duì)照。

其中分離方法包括乙醇分級(jí)沉淀、分子排阻、離子交換、反相柱層析等方法

乙醇分級(jí)沉淀：向海洋蛤類酶解液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為30％(v/v)，4℃靜置24h后，離心，下層沉淀為醇沉部位1，上清液濃縮后，加入無水乙醇，使乙醇終濃度為80％(v/v)，4℃靜置24h后，離心，下層沉淀為醇沉部位2，上清為醇沉部位3。

分子排阻色譜法：將海洋蛤類酶解液分批上樣于事先處理好的sephadex凝膠色譜柱，純化水洗脫，流速為0.15ml/min，自動(dòng)部份收集器收集，每2ml收集1管，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管254nm吸光度，繪制洗脫曲線，每個(gè)吸收峰收集合并，分離獲得不同部位，濃縮后冷凍干燥，凍干品-20℃保存待用。其中sephadex凝膠色譜柱包括sephadexg-25，g-50，g-75及g-100。

離子交換色譜法：將海洋蛤類酶解物凍干粉用緩沖液溶解(緩沖液ph范圍為6.0-8.5)，上樣后，用約5倍柱體積的緩沖液將未吸附部分洗脫出柱。而后0-0.5mnacl緩沖液階段洗脫或梯度洗脫，流速為1ml/min，自動(dòng)部份收集器收集，每3ml收集1管，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管254nm吸光度，繪制洗脫曲線，每個(gè)吸收峰收集合并，分離獲得不同部位，濃縮后冷凍干燥，得凍干品。其中色譜填料包括deaesepharose、cmsepharose、qsepharose等。

反相柱層析方法：采用制備型hplc系統(tǒng)，二元梯度泵，紫外可見分光光度檢測(cè)器；色譜柱選擇反相c18、t3、hilic等。流動(dòng)相a：0.1％tfa，流動(dòng)相b：甲醇；洗脫條件為：2％b，0-1.5min，2％-60％b，流速為15ml/min。上樣量為1ml。收集色譜峰，分離獲得不同部位，濃縮后冷凍干燥，凍干品-20℃保存待用。

本發(fā)明活性部位中活性多肽序列鑒定，采用c18固相萃取小柱脫鹽后，進(jìn)lc-ms/ms分析，選擇性挑選離子帶電荷≥2的母離子進(jìn)行碰撞解離獲得二級(jí)碎片信息(ms/ms)，通過軟件進(jìn)行denovosequencing分析，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載于www.uniprot.org)，確定活性部位中所有多肽的氨基酸序列。

活性部位采用nanolc-ms/ms進(jìn)行分析，戴安u3000nanorslc納升液相系統(tǒng)，色譜柱為5μmreprosilc18aq(75μm×150mm)，lc-ms/ms系統(tǒng)分析水牛角不同樣品。上樣量為5μl，流速400nl/min，流動(dòng)相a(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流動(dòng)相b(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2～30％b線性梯度洗脫60min。thermoltqorbitrapxl質(zhì)譜儀用于進(jìn)行肽段分析，噴霧電壓為2.5kv，離子傳輸毛細(xì)管溫度為200℃；質(zhì)譜一級(jí)全掃描范圍為m/z100～2000，分離寬度為3da；串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描模式，依次選取一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最高的5個(gè)離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(cid)二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜。采用xcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用peaks8.0軟件搜庫(kù)，選擇合適的數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索參數(shù)設(shè)置為：前體離子誤差10ppm；子離子誤差1da；半胱氨酸殘基固定修飾(氨甲酰甲基化57.0215da)；甲硫氨酸殘基可變修飾(氧化+15.9949da)；允許2個(gè)位點(diǎn)誤切，假陽性率(fdr)≤1％；根據(jù)水牛角水提液樣品不同，選擇不同酶切方式：非酶切(noenzyme)或胰蛋白酶酶切(trypsin)；其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(p<0.05)被認(rèn)定為有效的鑒定結(jié)果。

從而確定活性部位/成分群中全部多肽的氨基酸序列信息。

作為優(yōu)選：本發(fā)明將所有的活性多肽序列進(jìn)行同源模建，將所有多肽(配體)與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)(受體)導(dǎo)入分子對(duì)接軟件中，設(shè)定參數(shù)，用cdoker進(jìn)行分子對(duì)接，確定配體與受體的結(jié)合情況與結(jié)合參數(shù)，篩選確定能與受體結(jié)合的配體，明確具有潛在活性的多肽序列；進(jìn)一步通過固相合成驗(yàn)證分子對(duì)接篩選確定的多肽活性。

作為優(yōu)選：本發(fā)明配體構(gòu)建方法為：

根據(jù)多肽的氨基酸序列信息進(jìn)行同源模建：使用chembiodrawultra13.0軟件繪制各個(gè)多肽結(jié)構(gòu)，然后將其導(dǎo)入discoverystudio4.0(ds4.0)軟件中，再使用charmm能量場(chǎng)優(yōu)化并使其能量最小化，利用ds4.0中的preparligand模塊準(zhǔn)備配體。

從theproteindatabank的數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.rcsb.org/pdb/)下載蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，作為計(jì)算機(jī)分子對(duì)接的受體模型，使用軟件ds4.0中的cdocker模塊進(jìn)行分子對(duì)接研究，參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

經(jīng)過篩選獲得能夠與受體結(jié)合的配體，確定配體的氨基酸序列，采用固相合成技術(shù)合成多肽，采用體外活性評(píng)價(jià)方法驗(yàn)證其生物活性。

有益效果：本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)篩選，研究開發(fā)出一種快速、高效尋找海洋活性多肽的方法，本發(fā)明集成lc-ms/ms快速鑒定混合多肽與計(jì)算機(jī)高效篩選優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)，可從海洋生物(或酶解產(chǎn)物)中快速尋找活性多肽，可操作性強(qiáng)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明肽段his-asp-gln-leu-pro-gly-tyr的從頭測(cè)序(denovosequencing)結(jié)果圖。

圖2是肽段thr-pro-glu-lys-glu-asp-glu-leu-arg的denovosequencing結(jié)果圖。

圖3是肽段ala-asp-leu-asp-trp-leu-asp-gly-arg的denovosequencing結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。

實(shí)施例1

雜色蛤中篩選二肽基肽酶-iv(dpp-iv)抑制劑：

1.雜色蛤酶解物的制備：

將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分鐘，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加3倍量水勻漿后，加入酶活性為50000u/g的木瓜蛋白酶酶解，木瓜蛋白酶的加入重量為肉渣重量的1％，酶解的溫度為55℃，酶解的ph為7，酶解反應(yīng)時(shí)間為4h；酶解結(jié)束后,于沸水浴滅活，然后加入一定量的無水乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉，最終制備30％乙醇沉淀部位(醇沉部位1)、70％的醇沉沉淀部位(醇沉部位2)及醇沉上清液(醇沉部位3)，各部位經(jīng)濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉。

2.dpp-iv抑制活性評(píng)價(jià)

將醇沉部位1，2，3溶于tris-hci緩沖液(含20mmol/ltris,ph8.0,0.1mol/lnacl，1mmol/ledta)制成相應(yīng)的樣品液。二肽基肽酶-4(dpp-4)、gly-pro-pna分別用tris-hcl緩沖液(含20mmol/ltris,ph8.0,0.1mol/lnacl，1mmol/ledta)配置成8u/l的dpp-4溶液和1.6mmol/l的gly-pro-pna(底物)溶液。將25μl樣品與25μl底物混勻，37℃孵育10min,再加入50μldpp-4溶液，在37℃孵育1小時(shí)，后加入1mol/l醋酸鈉緩沖液(ph4.0)100μl,405nm處測(cè)定吸光度值(a)，并計(jì)算抑制率。同時(shí)用tris-hci緩沖液代替樣品做空白對(duì)照。

dpp-4抑制率(％)＝[(a陰性對(duì)照-a空白對(duì)照)-(a樣品-a樣品空白)]/(a陰性對(duì)照-a空白對(duì)照)×100％

式中：a為吸光度值。

結(jié)果見表，醇沉部位3的dpp-iv抑制活性最佳。

表1不同醇沉部位的dpp-iv抑制活性比較

3.活性部位3的lcms/ms分析

活性部位3經(jīng)質(zhì)譜分析得ms/ms質(zhì)譜碎片信息，采用非酶切(noenzyme)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，從其中共分析鑒定出了124個(gè)多肽氨基酸序列。以其中肽段his-asp-gln-leu-pro-gly-tyr為例，ms/ms圖譜見圖1，分子量(mw)為828.38da，碎片信息包括b1-b6，y1-y6，此肽段為denovosequencing分析結(jié)果，未在蛋白質(zhì)庫(kù)中搜索到來源蛋白質(zhì)。

4.124個(gè)多肽氨基酸序列的dpp-iv抑制活性分子對(duì)接研究

將124個(gè)多肽氨基酸序列同源建模，在ds4.0中進(jìn)行prepareligand，dpp-iv靶點(diǎn)由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝2p8s下載，在ds4.0中進(jìn)行去水、加氫再進(jìn)行prepareprotein，然后將配體與dpp-iv靶點(diǎn)進(jìn)行cdocker對(duì)接，參數(shù)設(shè)置如下：tophits-10；randomconformations-10；orientationstorefine-10；forcefield-charmm；usefullpotential-false，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置。

經(jīng)過對(duì)接后，確定5個(gè)多肽序列能夠與dpp-iv很好的對(duì)接，表明其為潛在的dpp-iv抑制活性多肽，5個(gè)多肽序列見表2。

通過固相合成技術(shù)獲得5個(gè)多肽，純度均>98％，體外dpp-iv活性評(píng)價(jià)5個(gè)多肽，結(jié)果見表2。

表25個(gè)多肽的dpp-iv抑制活性比較

由上表2結(jié)果表明，從雜色蛤酶解物中快速確定了dpp-iv抑制活性多肽。

實(shí)施例2

文蛤提取物中篩選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制肽：

1、文蛤提取物的制備

將文蛤軟體洗凈泥沙，加入3倍量60％乙醇煎煮2次，每次30分鐘，合并兩次提取液，濃縮后，冷凍干燥，得凍干粉。

2、文蛤提取物反相柱層析分離

將文蛤提取物凍干粉復(fù)溶，采用waters制備型hplc系統(tǒng)(2545-2489hplc系統(tǒng))，分離文蛤提取物，采用c18色譜柱(5μm,19×150mm)，二元梯度泵，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；流動(dòng)相a：0.1％tfa，流動(dòng)相b：甲醇；洗脫條件為：2％b，0-3min，2％-35％b，3-9min，流速為10ml/min。上樣量為500μl。收集色譜峰，分離獲得5個(gè)不同部位，濃縮后冷凍干燥，凍干品-20℃保存待用。

3、對(duì)5個(gè)部位進(jìn)行ace抑制活性評(píng)價(jià)

ace與hhl溶液的配制：取適量ace用0.1mol/l含0.3mol/lnacl硼酸緩沖液(ph8.3)配成濃度為100mu/ml的ace溶液；取適量hhl用0.1mol/l硼酸緩沖液(含0.3mol/lnaclph8.3)配成濃度為5mmol/l的hhl溶液；

反應(yīng)過程：將30μlhhl和10μl樣品(或緩沖溶液)混勻后，于37℃環(huán)境下預(yù)熱5min(37℃水浴)，再加入20μl的ace啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后繼續(xù)于37℃環(huán)境下反應(yīng)1h(37℃水浴)，然后迅速加入70μlhcl(1mol/l)終止反應(yīng)，用高效液相色譜分析結(jié)果。用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對(duì)照。

色譜條件：sunfire-c18柱(2.1×100mm，3.5μm，美國(guó)waters公司)；流動(dòng)相：乙腈-0.5％甲酸水溶液，流速：0.5ml/min；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：220nm、254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。梯度洗脫條件：0～5min，2％乙腈；5～25min，2％～40％乙腈；25～30min，40％乙腈。

ace抑制活性評(píng)價(jià)結(jié)果見表3，其中部位3活性較好。

表3文蛤提取物5個(gè)部位的ace抑制活性比較

其中部位3的ace抑制活性最佳。

4、ace抑制活性部位3的lcms/ms分析

活性部位3經(jīng)質(zhì)譜分析得ms/ms質(zhì)譜碎片信息，采用非酶切(noenzyme)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，從其中共分析鑒定出了131個(gè)多肽氨基酸序列。以其中肽段thr-pro-glu-lys-glu-asp-glu-leu-arg為例，ms/ms圖譜見圖2，分子量(mw)為1115.55da，碎片信息包括b2-b8，y1-y8，此肽段為denovosequencing分析結(jié)果，未在蛋白質(zhì)庫(kù)中搜索到來源蛋白質(zhì)。

5.131個(gè)多肽氨基酸序列的ace抑制活性分子對(duì)接研究

將131個(gè)多肽氨基酸序列同源建模，在ds4.0中進(jìn)行prepareligand，ace靶點(diǎn)由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝1o86下載，在ds4.0中進(jìn)行去水、加氫再進(jìn)行prepareprotein，然后將配體與ace靶點(diǎn)進(jìn)行cdocker對(duì)接，參數(shù)設(shè)置如下：tophits-10；randomconformations-10；orientationstorefine-10；forcefield-charmm；usefullpotential-false，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置。

經(jīng)過對(duì)接后，確定6個(gè)多肽序列能夠與ace很好的對(duì)接，表明其為潛在的ace抑制活性多肽，6個(gè)多肽序列見表4。

通過固相合成技術(shù)獲得6個(gè)多肽，純度均>98％，體外ace活性評(píng)價(jià)6個(gè)多肽，結(jié)果見表4。

表46個(gè)多肽的ace抑制活性比較

由上表4從文蛤提取物中快速確定了ace抑制活性多肽。

實(shí)施例3毛蚶中具有凝血酶抑制劑活性的多肽的篩選與發(fā)現(xiàn)

1.毛蚶酶解物的制備：

將毛蚶軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分鐘，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加3倍量水勻漿后，加入酶活性為10000u/g的中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶的加入重量為肉渣重量的2％，酶解的溫度為45℃，酶解的ph為7，酶解反應(yīng)時(shí)間為4h；酶解結(jié)束后，于沸水浴滅活，冷凍干燥，得到凍干粉。

2.毛蚶酶解物分子排阻分離

將毛蚶酶解物凍干粉復(fù)溶，離心后上清分批上樣于sephadexg-25凝膠柱，純化水洗脫，流速為0.15ml/min，自動(dòng)部份收集器收集，每2ml收集1管，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管254nm吸光度，繪制洗脫曲線，每個(gè)吸收峰收集合并，得到g1，g3，g3和g4部位，各部位濃縮后冷凍干燥，凍干品-20℃保存待用。

3.對(duì)4個(gè)部位進(jìn)行凝血酶抑制活性評(píng)價(jià)

家兔頸總動(dòng)脈取血，3000rpm離心10min制備待測(cè)血漿。在測(cè)定杯中加入待測(cè)血漿40μl，37℃預(yù)溫3min后加入共同預(yù)溫一定時(shí)間的0.1mol/lph7.4tris-hcl緩沖液稀釋的15u/ml凝血酶溶液40μl和溶媒20μl。在加入凝血酶溶液的同時(shí)啟動(dòng)凝血因子分析儀記錄凝血時(shí)間(tt0)。tt延長(zhǎng)率(％)＝(tt-tt0)/tt0×100％。用不同濃度的凝血酶，測(cè)得凝血時(shí)間tt。計(jì)算tt延長(zhǎng)率(％)。以lgtt延長(zhǎng)率(％)對(duì)凝血酶濃度(c)作圖，得c對(duì)lgtt延長(zhǎng)率(％)的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在測(cè)定杯中加入待測(cè)血漿40μl，37℃預(yù)溫3min后，加入共同預(yù)溫3min的待測(cè)樣品20μl和15u/ml凝血酶40μl，記錄凝血時(shí)間(tt)，計(jì)算lgtt延長(zhǎng)率(％)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算凝血酶活力，以溶媒作對(duì)照。

凝血酶抑制活性評(píng)價(jià)結(jié)果見表5，其中g(shù)3部位活性較好。

表5毛蚶酶解物4個(gè)部位的凝血酶抑制活性比較

4.g3部位的lcms/ms分析

活性部位g3經(jīng)質(zhì)譜分析得ms/ms質(zhì)譜碎片信息，采用非酶切(noenzyme)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，從其中共分析鑒定出了87個(gè)多肽氨基酸序列。以其中肽段ala-asp-leu-asp-trp-leu-asp-gly-arg為例，ms/ms圖譜見圖3，分子量(mw)為1059.50da，碎片信息包括b2-b8，y1-y8，此肽段為denovosequencing分析結(jié)果，未在蛋白質(zhì)庫(kù)中搜索到來源蛋白質(zhì)。

5.87個(gè)多肽氨基酸序列的凝血酶抑制活性分子對(duì)接研究

將87個(gè)多肽氨基酸序列同源建模，在ds4.0中進(jìn)行prepareligand，凝血酶靶點(diǎn)由http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝3c1k下載，在ds4.0中進(jìn)行去水、加氫再進(jìn)行prepareprotein，然后將配體與凝血酶靶點(diǎn)進(jìn)行cdocker對(duì)接，參數(shù)設(shè)置如下：tophits-10；randomconformations-10；orientationstorefine-10；forcefield-charmm；usefullpotential-false，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置。

經(jīng)過對(duì)接后，確定3個(gè)多肽序列能夠與凝血酶很好的對(duì)接，表明其為潛在的凝血酶抑制活性多肽，3個(gè)多肽序列見表6。

通過固相合成技術(shù)獲得3個(gè)多肽，純度均>98％，體外凝血酶活性評(píng)價(jià)3個(gè)多肽，結(jié)果見表6。

表63個(gè)多肽的ace抑制活性比較

由上表6結(jié)果表明，從毛蚶酶解物中快速確定了凝血酶抑制活性多肽。

sequencelisting

<110>南京中醫(yī)藥大學(xué)

<120>基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接的活性多肽高通量篩選方法<130>

<160>14

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

hisaspglnleuproglytyr

15

<210>2

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

alaleugluaspglualaarg

157

<210>3

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

hisleulysaspglyvalmet

157

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

phealaglyaspaspalaproarg

158

<210>5

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<400>5

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156

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>6

thrproglulysgluaspgluleuarg

159

<210>7

<211>8

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<213>人工序列

<400>7

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158

<210>8

<211>7

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<213>人工序列

<400>8

trptyrgluglulysmetglu

157

<210>9

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<400>9

aspsertyrvalglyaspglualaglnserlys

151011

<210>10

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>10

asntrpaspaspmetglulysiletrp

159

<210>11

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>11

glupheaspaspglutrplyssermet

159

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>12

alaaspleuasptrpleuaspglyarg

159

<210>13

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<400>13

gluleuargglngluglngluasntyrlys

1510

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<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>14

glupheaspaspglutrplyssermet

159