本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2014年7月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?01410312327.2、發(fā)明名稱為“用于生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2013年7月2日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)no.10-2013-0077335的優(yōu)先權(quán)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

本發(fā)明涉及用于具有高靈敏度的生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器，其中所述試劑組合物能夠改善分析物(例如葡萄糖)的分析線性、檢測(cè)少量分析物的濃度以及使測(cè)量血糖所需的血液盡可能少。

背景技術(shù)：

本發(fā)明涉及用于生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器，并且特別地涉及用于對(duì)生物樣品中的特定成分進(jìn)行定量的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器。

最近，隨著糖尿病患者數(shù)量的增加，為了診斷和預(yù)防糖尿病，定期測(cè)量血糖量的必要性一直在增加。已知這樣的糖尿病是重要的健康風(fēng)險(xiǎn)因素。通常，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(americandiabetesassociation，ada)推薦大多數(shù)胰島素依賴性糖尿病患者每天檢查血糖三次或更多。胰島素控制血糖的利用并預(yù)防高血糖癥，在未對(duì)糖尿病進(jìn)行治療時(shí)，高血糖癥可導(dǎo)致酮病。但是，胰島素治療的不恰當(dāng)管理(management)可導(dǎo)致低血糖癥。由于低血糖癥可導(dǎo)致昏迷，所以其對(duì)于患者而言可能是致命的。

此外，當(dāng)患者長(zhǎng)期患有糖尿病時(shí)，可導(dǎo)致并發(fā)癥，例如心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、失明、中風(fēng)、高血壓和腎衰竭。由于胰島素注射量與血糖的量相關(guān)，所以精確檢測(cè)血糖對(duì)于適當(dāng)?shù)刂委熖悄虿∈潜匾摹?/p>

因此，生產(chǎn)了多種血糖儀以使得可以使用便攜式儀器容易地測(cè)量血糖。通常，在血糖儀中，每位使用者使用條型生物傳感器(strip-typebiosensor)。這樣的生物傳感器的操作原理基于光學(xué)方法或電化學(xué)方法。

在這些方法中，電化學(xué)方法的最大特征是使用電子傳遞介質(zhì)(electrontransfermediator)。作為電子傳遞介質(zhì)，可以使用：二茂鐵、二茂鐵的衍生物；醌、醌的衍生物；含過(guò)渡金屬的有機(jī)物質(zhì)和無(wú)機(jī)物質(zhì)(例如，六胺合釕、含鋨聚合物和鐵氰化鉀)；以及電子傳遞有機(jī)物質(zhì)，例如有機(jī)導(dǎo)電鹽和紫羅堿(viologen)。

使用電化學(xué)方法測(cè)量血糖的原理如下。首先，由于葡萄糖氧化酶的催化作用，血糖氧化成葡萄糖酸鹽。同時(shí)，作為葡萄糖氧化酶的活性位點(diǎn)的fad被還原成fadh2。然后，經(jīng)還原的fadh2通過(guò)與電子傳遞介質(zhì)的氧化還原反應(yīng)被氧化成fad，而電子傳遞介質(zhì)被還原。由以這種方式形成的還原態(tài)電子傳遞介質(zhì)產(chǎn)生的電子分散到電極表面。此時(shí)，通過(guò)測(cè)量由還原態(tài)電子傳遞介質(zhì)的氧化電勢(shì)施加于工作電極表面產(chǎn)生的電流來(lái)測(cè)量血糖濃度。

與采用常規(guī)光學(xué)方法的生物傳感器不同，采用上述測(cè)量原理的電化學(xué)生物傳感器可降低氧的影響，并且即使在樣品渾濁時(shí)也可使用樣品而無(wú)需分離預(yù)處理。

此外，一般的電化學(xué)生物傳感器制作成使得采用諸如絲網(wǎng)印刷(screenprinting)的方法在電絕緣基板上形成包括多個(gè)電極的電極系統(tǒng)，并且在所形成的電極系統(tǒng)上形成由親水聚合物、氧化還原酶和電子受體形成的酶反應(yīng)層。當(dāng)包含底物的樣品溶液滴在電化學(xué)生物傳感器的酶反應(yīng)層上時(shí)，酶反應(yīng)層溶解，底物與酶反應(yīng)，底物被氧化，從而電子受體被還原。在酶反應(yīng)完成后，可以由通過(guò)對(duì)還原的電子受體進(jìn)行電化學(xué)氧化而獲得的氧化電流來(lái)獲得樣品溶液中底物的濃度。

當(dāng)使用這樣的生物傳感器時(shí)，使用少量樣品精確快速地獲得測(cè)量值對(duì)于最大限度方便使用者是非常重要的問(wèn)題。大多數(shù)用于測(cè)量血糖的產(chǎn)品使用采集血樣然后用生物傳感器量化血液中的血糖的方法。但是，由于采集血樣對(duì)于患者來(lái)說(shuō)是相當(dāng)疼痛的操作，所以有必要使測(cè)量所必需的血液量盡可能少以減輕患者的疼痛。特別地，當(dāng)使用1μl或更少量的樣品、優(yōu)選地使用0.5μl或更少量的樣品、更優(yōu)選0.3μl或更少量的樣品時(shí)，由于可以從替代部位(例如前臂)采集血樣和進(jìn)行測(cè)量，所以可以使在患者測(cè)量血糖時(shí)導(dǎo)致的疼痛盡可能小。因此，生物傳感器需要使測(cè)量血糖所必需的血液量盡可能少。

此外，該生物傳感器的另一個(gè)問(wèn)題是測(cè)量的靈敏度隨小型化而降低。固定至電極表面的反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的量是影響生物傳感器的靈敏度的主要因素之一。但是，最近，隨著生物傳感器的逐漸小型化，與特定物質(zhì)反應(yīng)的物質(zhì)可固定的面積也隨之減小。因此，嚴(yán)重限制了具有高靈敏度的緊湊型傳感器的開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了用于具有高靈敏度的生物傳感器的試劑組合物，其能夠改善分析物(例如葡萄糖)的分析線性，并且使測(cè)量分析物(例如葡萄糖)所必需的血液盡可能少。

本發(fā)明還提供了生物傳感器，其使用所述試劑組合物，并且能夠以工業(yè)和經(jīng)濟(jì)上可用的方式測(cè)量分析物例如葡萄糖。

通過(guò)描述示例性實(shí)施例的以下描述，本發(fā)明的上述和其他目的和效果將變得明顯。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于生物傳感器的試劑組合物，其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質(zhì)，其中所述至少兩種電子傳遞介質(zhì)包括萘酚綠b(naphtholgreenb)。這里，所述電子傳遞介質(zhì)還可包括含金屬配合物。

優(yōu)選地，所述含金屬配合物可以是釕配合物或鐵氰化物配合物。

優(yōu)選地，所述釕配合物可以是選自以下的至少一種：ru(nh3)6cl3、[ru(2，2′，2″-三聯(lián)吡啶)(1，10-菲咯啉)(oh2)]²⁺、反式-[ru(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh2)(oh)]²⁺、[(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh)ruoru(oh)(2，2′bpy)2]⁴⁺和[ru(4，4′-聯(lián)吡啶)(nh3)5]²⁺。

這里，相對(duì)于100重量份的緩沖液，可以使用等于或大于0.1重量份并且等于或小于20重量份的萘酚綠b。

這里，所述酶可以是氧化還原酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶或水解酶中的任何酶。

優(yōu)選地，所述氧化還原酶可以是選自以下的至少一種：黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶(flavinadeninedinucleotide-glucosedehydrogenase)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶(nicotinamideadeninedinucleotide-glucosedehyrogenase)、吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶(pyrroloquinolinequinineglucosedehydrogenase)、谷氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。

優(yōu)選地，所述試劑組合物還可包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩(wěn)定劑中的至少一種。

更優(yōu)選地，所述表面活性劑可以是非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。

更優(yōu)選地，所述水溶性聚合物可以是聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(hec)、羥丙基纖維素(hpc)、羧甲基纖維素(cmc)、醋酸纖維素和聚酰胺中的至少一種。

這里，所述試劑組合物可以是用于葡萄糖生物傳感器的試劑組合物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于測(cè)量樣品中的分析物的生物傳感器。所述生物傳感器包括：下基板，所述下基板在其表面上包含至少一個(gè)電極，所述電極上施加有與所述分析物反應(yīng)的試劑組合物；形成在所述下基板上的分隔件(spacer)，所述分隔件在面向所述電極的表面上包含樣品注入單元，以使得將樣品吸入并引入到電極的位置；和設(shè)置在所述分隔件上的上基板，其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質(zhì)，所述至少兩種電子傳遞介質(zhì)包括萘酚綠b。

優(yōu)選地，所述電子傳遞介質(zhì)還可包括含金屬配合物。

優(yōu)選地，所述酶可以是氧化還原酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶或水解酶中的任何酶。

優(yōu)選地，所述含金屬配合物可以是釕配合物或鐵氰化物配合物。

附圖說(shuō)明

通過(guò)參照附圖詳細(xì)描述其示例性實(shí)施方案，本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得更明顯。

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的生物傳感器的分解透視圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明的比較例1至3的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明的比較例4至6的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖；以及

圖4是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1至4的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

在下文中，將參照本發(fā)明的實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅示例性地提供以更具體地描述本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述用于生物傳感器的組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質(zhì)，所述至少兩種電子傳遞介質(zhì)包括萘酚綠b。

充當(dāng)電子傳遞介質(zhì)的萘酚綠b是萘酚綠y的鈉鹽，其具有良好的溶解性、在工業(yè)上廉價(jià)并且在多個(gè)領(lǐng)域中用作染料。

另外，所述電子傳遞介質(zhì)包括含金屬配合物。

這里，可使用可通過(guò)與酶反應(yīng)被氧化或還原的物質(zhì)作為含金屬配合物，例如鐵氰化物配合物、鐵氰化鉀、釕配合物、六胺氯化釕(hexaamminerutheniumchloride)、二茂鐵及其衍生物、醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)及其衍生物、對(duì)苯醌及其衍生物、2，6-二氯靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol)、亞甲基藍(lán)、硝基四氮唑藍(lán)和鋨配合物。其中，優(yōu)選使用釕配合物或鐵氰化物配合物作為含金屬配合物，更優(yōu)選地，可使用六胺氯化釕和鐵氰化鉀，最優(yōu)選地，可使用六胺氯化釕。

本發(fā)明的釕配合物可以是選自以下的釕配合物：ru(nh3)6cl3、[ru(2，2′，2″-三聯(lián)吡啶)(1，10-菲咯啉)(oh2)]²⁺、反式-[ru(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh2)(oh)]²⁺、[(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh)ruoru(oh)(2，2′bpy)2]⁴⁺和[ru(4，4′-聯(lián)吡啶)(nh3)5]²⁺。最優(yōu)選的釕配合物是六胺氯化釕，其具有以下性質(zhì)：氧化-還原狀態(tài)在水溶液中穩(wěn)定并且可逆；經(jīng)還原的電子傳遞介質(zhì)不與氧反應(yīng)；經(jīng)還原的電子傳遞介質(zhì)的氧化對(duì)ph不敏感；并且?guī)缀醪慌c電化學(xué)干擾物質(zhì)(例如乙酰氨基酚(acetaminophene)、抗壞血酸、膽紅素、多巴胺、尿酸和龍膽酸)反應(yīng)。

此外，可使用氧化還原酶以及多種水解酶和轉(zhuǎn)移酶作為所述酶，例如葡萄糖脫氫酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(got)和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(gpt)。

所述氧化還原酶是選自以下的任何酶：黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。因此，當(dāng)選擇氧化還原酶之一、選擇與其反應(yīng)的樣品分析物并制備試劑組合物時(shí)，可提供用于檢測(cè)葡萄糖、膽固醇、乳酸(lactate)、谷氨酸(glutamate)和醇中的任意一種的生物傳感器。

如下文將描述的，可以看到，在本發(fā)明同時(shí)使用六胺氯化釕和萘酚綠b的實(shí)施例中，葡萄糖檢測(cè)性能顯著提高。

可通過(guò)樣品或待使用的氧化還原酶適當(dāng)?shù)卮_定電子傳遞介質(zhì)。另外，可將包括萘酚綠b的兩種或更多種電子傳遞介質(zhì)組合并使用。

電子傳遞介質(zhì)的含量沒(méi)有特別的限制，而是可通過(guò)樣品的添加量等來(lái)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。優(yōu)選地，電子傳遞介質(zhì)被優(yōu)選地制備成緩沖液，例如甘氨酸。

同時(shí)，以下反應(yīng)式表示使用氧化還原酶和電子傳遞介質(zhì)的電化學(xué)傳感器的測(cè)量原理。

[反應(yīng)式]

分析物+酶(氧化態(tài))+電子傳遞介質(zhì)(氧化態(tài))＝＝＝＞反應(yīng)所得物質(zhì)+酶(氧化態(tài))+電子傳遞介質(zhì)(還原態(tài))

在該反應(yīng)式中，通過(guò)與樣品中的分析物反應(yīng)而產(chǎn)生的還原態(tài)電子傳遞介質(zhì)與樣品中分析物的濃度成正比。使用該比例，基于參考電極或輔助電極，向工作電極施加恒定電壓以使還原態(tài)的電子傳遞介質(zhì)氧化。測(cè)量此時(shí)產(chǎn)生的氧化電流水平以量化樣品中的分析物。

如上所述，酶與多種待測(cè)量代謝物反應(yīng)并被還原。然后，經(jīng)還原的酶與電子傳遞介質(zhì)反應(yīng)并量化代謝物。

此外，根據(jù)本發(fā)明的方面，用于生物傳感器的試劑組合物還可包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩(wěn)定劑中的至少一種。

通過(guò)包含表面活性劑，顯著抑制和阻止了氧化還原酶固定至電極。因此，由于在電極附近的氧化還原酶，可提高從氧化型電子載體到還原型電子載體的轉(zhuǎn)化效率。換言之，可進(jìn)一步增加與樣品溶液中底物濃度的相關(guān)性。可選擇性調(diào)節(jié)表面活性劑的量和形式以避免對(duì)酶的變性作用。

表面活性劑沒(méi)有特別的限制，只要不降低本發(fā)明的酶活性即可。例如，可適當(dāng)?shù)剡x擇和使用非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。這些表面活性劑可單獨(dú)使用或以其混合物使用。一種優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯醚。更優(yōu)選地，可購(gòu)買和使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(商標(biāo)：tritonx-100)。相對(duì)于100重量份的緩沖液，試劑混合物中tritonx-100的濃度優(yōu)選為0.01重量份至2重量份。

此外，添加劑中的水溶性聚合物是試劑組合物的聚合物支架，其穩(wěn)定和分散酶。作為水溶性聚合物，可使用聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(hec)、羥丙基纖維素(hpc)、羧甲基纖維素(cmc)、醋酸纖維素和聚酰胺中的至少一種。

盡管本說(shuō)明書以示例描述了所述生物傳感器用于測(cè)量血糖以便于描述，但是與血糖測(cè)試應(yīng)用類似，可以通過(guò)引入適于特定酶的電子傳遞介質(zhì)，采用相同的方法來(lái)量化多種代謝物的濃度，例如，生物樣品，例如膽固醇、乳酸、肌酸酐、蛋白質(zhì)、過(guò)氧化氫、醇、氨基酸；和酶，例如谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(gpt)和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(got)，以及環(huán)境樣品、農(nóng)業(yè)和工業(yè)樣品或食物樣品中的多種有機(jī)物質(zhì)或無(wú)機(jī)物質(zhì)。

因此，應(yīng)理解，通過(guò)改變本說(shuō)明書中所述試劑組合物中包含的酶的種類，本發(fā)明可用于量化多種代謝物。例如，可使用血糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽固醇氧化酶、谷氨酸氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、醇氧化酶等來(lái)量化膽固醇、乳酸、谷氨酸、過(guò)氧化氫和醇。優(yōu)選使用選自以下的氧化酶：葡萄糖氧化酶(gox)、葡萄糖脫氫酶(gdh)、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶、膽紅素氧化酶和葡萄糖脫氫酶。

接下來(lái)，將參照?qǐng)D1詳細(xì)描述生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案，圖1為根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面的生物傳感器的分解透視圖。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面的生物傳感器可應(yīng)用于常規(guī)的已知傳感器，例如甘油三酯傳感器和膽固醇傳感器。包含根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物的生物傳感器主要由下基板100、分隔件200和上基板300構(gòu)成。

下基板100是絕緣基板，其中在表面上設(shè)置有電極21至23中的至少一個(gè)，與樣品中的分析物反應(yīng)的上述試劑組合物施加在所述電極上。

分隔件200形成在下基板100上，并且可接合在下基板100與上基板300之間。可在面向電極的側(cè)表面進(jìn)一步設(shè)置樣品注入單元30，以使得將分析物樣品吸入并引入下基板100的電極21至23。

上基板300是絕緣基板，其面向下基板100，設(shè)置在分隔件200上，并且還包括空氣排放單元40，該空氣排放單元40配置為排放通過(guò)樣品注入單元30與分析物樣品一起吸入的空氣。

在這種情況下，為了提高樣品的吸入速率，空氣排放單元40可在與樣品注入單元30分開(kāi)的層中形成為通道形狀。特別地，空氣排放單元40可優(yōu)選地具有在垂直于樣品吸入方向的方向上形成的半圓柱形形狀。

更特別地，下基板100可使用由絕緣材料(例如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚酰亞胺、丙烯酸樹(shù)脂、聚酯、pvc或聚碳酸酯)制成的薄板。下基板100可使用厚度為50至400μm的絕緣材料，更優(yōu)選地，厚度為100至300μm的絕緣材料。

在下基板100的頂部形成與測(cè)量裝置(未示出)和電極系統(tǒng)20接觸的引線24至26，在所述電極系統(tǒng)20中印刷有與所述引線相連并且配置為檢測(cè)在吸入樣品中流動(dòng)的電信號(hào)的電極21至23。這里，所述電極可包括工作電極23、參考電極22和檢查電極21。引線24至26可通過(guò)諸如一般的絲網(wǎng)印刷的方法形成。此外，電極21至23可使用導(dǎo)電碳墨(碳膏)通過(guò)絲網(wǎng)印刷方法形成。

同時(shí)，為了使電極21至23相互絕緣，可用絕緣體(絕緣膏)部分地涂覆除了電極21至23的一些上表面以外的部分以形成絕緣層?？墒褂梅菍?dǎo)電絲網(wǎng)印刷墨或絕緣墨作為這樣的絕緣體。

如上所述，在部分地印刷有絕緣體的部分以外的部分中，電極21至23暴露的上表面涂覆有試劑組合物。所述試劑組合物包含與注入的樣品反應(yīng)的酶和上述電子傳遞介質(zhì)(電子受體)。試劑組合物被施加到電極上并固定于此，從而充分覆蓋電極21至23。此外，可將試劑組合物施加到電極21至23中的全部或至少一個(gè)電極上或者僅工作電極23上并使用。

當(dāng)通過(guò)樣品注入單元30將包含分析物的樣品注入試劑組合物中時(shí)，樣品中包含的分析物與酶反應(yīng)，分析物被氧化，并且相應(yīng)地電子受體被還原。在酶反應(yīng)完成后，通過(guò)與連接至電極21至23的引線24至26接觸的測(cè)量裝置(未示出)測(cè)量通過(guò)對(duì)還原的電子受體進(jìn)行電化學(xué)氧化而獲得的氧化電流。因此，可以測(cè)量樣品中所含分析物的濃度。

分隔件200通過(guò)樣品注入單元30形成毛細(xì)管，所述樣品注入單元30通過(guò)接合上基板300與下基板100而形成。這使得能夠快速吸入分析物樣品。

分隔件200可由雙面帶(double-sidetape)制成。由于毛細(xì)管現(xiàn)象，待測(cè)量樣品通過(guò)樣品注入單元30自動(dòng)注入。由于樣品的引入，樣品注入單元30中的空氣通過(guò)形成在上基板300中的空氣排放單元40向外排放。

同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的電極21至23通過(guò)使用以下材料制作：導(dǎo)電聚合物、碳、ito顆粒、金屬顆粒、石墨和經(jīng)鉑處理的碳、銀、金、鈀或鉑組分。例如，使用由碳或經(jīng)鉑處理的碳制備的墨或含鈀墨來(lái)將電極21至23印刷在下基板100上。此外，可使用金通過(guò)真空沉積在下基板100上形成電極21至23。

在下文中，將參照實(shí)施例和比較例詳細(xì)描述本發(fā)明的配置和所得效果。但是，提供這些實(shí)施例僅用于更具體地描述本發(fā)明，而本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。

[實(shí)施例1]

試劑組合物的制備

制備ph6.5的50mmaces緩沖液(aces：n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)。將0.6重量份的聚乙二醇放進(jìn)100重量份的所制備緩沖液中并溶解。然后，相繼添加0.1重量份的表面活性劑叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(商標(biāo)：tritonx-100)和1.4重量份的酶穩(wěn)定劑(d-(+)-海藻糖二水合物)并溶解。

向溶液中相繼添加2.3重量份的六胺氯化釕(ru(nh3)6cl3)、0.9重量份的萘酚綠b和0.15重量份的黃素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脫氫酶(fad-gdh)并溶解，從而制備試劑組合物。

生物傳感器的制作

通過(guò)絲網(wǎng)印刷方法使用導(dǎo)電碳膏在聚酯下基板上形成工作電極、參考電極和檢查電極。使用烘箱將這些電極在120℃干燥20分鐘，然后使用絲網(wǎng)印刷方法施加絕緣膏。

用1mg試劑組合物涂覆工作電極并在烘箱中于40℃干燥20分鐘。將分隔件附著至經(jīng)干燥的下基板。然后覆蓋上基板并壓制。

[實(shí)施例2]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。除了萘酚綠b為1.8重量份外，其他組分的濃度相同。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[實(shí)施例3]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。除了萘酚綠b為3.5重量份外，其他組分的濃度相同。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[實(shí)施例4]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。除了萘酚綠b為6.6重量份外，其他組分的濃度相同。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例1]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成六胺氯化釕的濃度為1.5重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含萘酚綠b。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例2]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成六胺氯化釕的濃度為3.1重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含萘酚綠b。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例3]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成六胺氯化釕的濃度為4.6重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含萘酚綠b。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例4]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成萘酚綠b的濃度為4.4重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含六胺氯化釕。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例5]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成萘酚綠b的濃度為8.8重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含六胺氯化釕。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[比較例6]

按照實(shí)施例1制備試劑組合物。但是，將試劑組合物制備成萘酚綠b的濃度為13.2重量份，fad-gdh為0.15重量份，并且不含六胺氯化釕。

與實(shí)施例1相同地制作生物傳感器。

[實(shí)驗(yàn)實(shí)施例]

使用由實(shí)施例和比較例制作的生物傳感器測(cè)量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中的電流。這里，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液是指這樣的血液，其中由靜脈采集的血液具有42％的血細(xì)胞比容并且使用葡萄糖分析儀(制造商：ysiinc.，型號(hào)名稱：ysi2300statplus)具有多種葡萄糖濃度。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的比較例1至3的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖。在圖2中，t1表示包含1.5重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的比較例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t2表示包含3.1重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的比較例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t3表示包含4.6重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的比較例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

使用根據(jù)比較例1至3的生物傳感器進(jìn)行實(shí)施例實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，確定了在試劑組合物中不含萘酚綠b的生物傳感器中，通過(guò)葡萄糖濃度測(cè)量的電流未逐漸增加并且不能確保線性。

圖3是根據(jù)本發(fā)明的比較例4至6的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖。在圖3中，t1表示包含4.4重量份的萘酚綠b和0.15重量份的fad-gdh的比較例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t2表示包含8.8重量份的萘酚綠b和0.15重量份的fad-gdh的比較例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t3表示包含13.2重量份的萘酚綠b和0.15重量份的fad-gdh的比較例6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

使用根據(jù)比較例4至6的生物傳感器進(jìn)行實(shí)施例實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，確定了在試劑組合物中不含六胺氯化釕的生物傳感器中，通過(guò)葡萄糖濃度測(cè)量的電流未逐漸增加并且不能確保線性。

圖4是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1至4的葡萄糖測(cè)量電流變化曲線圖。在圖4中，t1表示包含0.9重量份的萘酚綠b、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t2表示包含1.8重量份的萘酚綠b、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。t3表示包含3.5重量份的萘酚綠b、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后，t4表示包含6.6重量份的萘酚綠b、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的fad-gdh的實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

使用根據(jù)實(shí)施例1至4的生物傳感器進(jìn)行實(shí)施例實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，總體而言，確定了通過(guò)葡萄糖濃度測(cè)量的電流隨著萘酚綠b濃度的增加而逐漸增加。此外，確定了線性隨著萘酚綠b濃度的增加而改善。特別地，確定了當(dāng)萘酚綠b濃度為3.5重量份時(shí)，表現(xiàn)出最佳線性。

為了誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，相對(duì)于100重量份的緩沖液，根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)方面的試劑組合物可優(yōu)選地使用濃度為等于或大于0.1重量份并且等于或小于20重量份的萘酚綠b，更優(yōu)選地，使用濃度為等于或大于1重量份并且等于或小于5重量份的萘酚綠b。這是因?yàn)闈舛葹樾∮?重量份的萘酚綠b可造成來(lái)自反應(yīng)的輸出信號(hào)低，因此不利地使得無(wú)法確保線性，另一方面，濃度為大于20重量份的萘酚綠b可導(dǎo)致試劑組合物的溶解度劣化，這可造成無(wú)法確保線性和再現(xiàn)性。最優(yōu)選的，相對(duì)于100重量份的緩沖液，試劑組合物可使用濃度等于3.5重量份的萘酚綠b。

同時(shí)，在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的電化學(xué)生物傳感器中，可將工作電極、參考電極和檢查電極設(shè)置在下基板的平面上。但是，也可將工作電極、參考電極和檢查電極設(shè)置在不同表面(例如，上基板)并面向彼此。

根據(jù)本發(fā)明，可改善分析物的分析線性，并且由于可檢測(cè)少量分析物的濃度，使測(cè)量血糖所必需血液盡可能少。

由于根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的試劑組合物的萘酚綠b具有良好的溶解性，所以其易于工業(yè)化使用，并且也廉價(jià)。因此，可提供廉價(jià)的生物傳感器，其對(duì)于需要每天多次測(cè)量血糖的人非常有用。

但是，本發(fā)明的效果不限于上述效果。通過(guò)以下描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可清楚地理解本發(fā)明其他未提到的效果。

盡管在上文中具體地描述了本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施例，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行多種修改和替代，并且可理解，這樣的修改和替代落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

以下內(nèi)容對(duì)應(yīng)于母案申請(qǐng)中的原始權(quán)利要求書，現(xiàn)作為說(shuō)明書的一部分并入此處：

1.用于生物傳感器的試劑組合物，

其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質(zhì)，其中所述至少兩種電子傳遞介質(zhì)中包含萘酚綠b。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑組合物，

其中所述電子傳遞介質(zhì)中還包含含金屬配合物。

3.根據(jù)項(xiàng)2所述的試劑組合物，

其中所述含金屬配合物是釕配合物或鐵氰化物配合物。

4.根據(jù)項(xiàng)3所述的試劑組合物，

其中所述釕配合物是選自以下的至少一種：ru(nh3)6cl3、[ru(2，2′，2″-三聯(lián)吡啶)(1，10-菲咯啉)(oh2)]²⁺、反式-[ru(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh2)(oh)]²⁺、[(2，2′-聯(lián)吡啶)2(oh)ruoru(oh)(2，2′bpy)2]⁴⁺和[ru(4，4′-聯(lián)吡啶)(nh3)5]²⁺。

5.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑組合物，

其中相對(duì)于100重量份的緩沖液，使用等于或大于0.1重量份并且等于或小于20重量份的所述萘酚綠b。

6.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑組合物，

其中所述酶是任何以下的酶：氧化還原酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶或水解酶。

7.根據(jù)項(xiàng)6所述的試劑組合物，

其中所述氧化還原酶是選自以下的至少一種：黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。

8.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑組合物，

其中所述試劑組合物還包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩(wěn)定劑中的至少一種。

9.根據(jù)項(xiàng)8所述的試劑組合物，

其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。

10.根據(jù)項(xiàng)8所述的試劑組合物，

其中所述水溶性聚合物是聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(hec)、羥丙基纖維素(hpc)、羧甲基纖維素(cmc)、醋酸纖維素和聚酰胺中的至少一種。

11.根據(jù)項(xiàng)1至10中任一項(xiàng)所述的試劑組合物，

其中所述試劑組合物是用于葡萄糖生物傳感器的試劑組合物。

12.一種用于測(cè)量樣品中的分析物的生物傳感器，所述生物傳感器包含：

下基板，所述下基板在其表面上包含至少一個(gè)電極，所述電極上施加有與所述分析物反應(yīng)的試劑組合物；

形成在所述下基板上的分隔件，所述分隔件在面向所述電極的表面上包含樣品注入單元，以使得所述樣品被吸入并引入到所述電極的位置；和

設(shè)置在所述分隔件上的上基板，

其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質(zhì)，其中所述至少兩種電子傳遞介質(zhì)中包含萘酚綠b。

13.根據(jù)項(xiàng)12所述的生物傳感器，

其中所述電子傳遞介質(zhì)還包含含金屬配合物。

14.根據(jù)項(xiàng)12所述的生物傳感器，

其中所述上基板還包含空氣排放單元，所述空氣排放單元配置為排放所述樣品中的空氣。

15.根據(jù)項(xiàng)14所述的生物傳感器，

其中所述空氣排放單元具有在垂直于樣品吸入方向的方向上形成的半圓柱形形狀。

16.根據(jù)項(xiàng)12所述的生物傳感器，

其中所述酶是任何以下的酶：氧化還原酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶或水解酶。

17.根據(jù)項(xiàng)13所述的生物傳感器，

其中所述含金屬配合物是釕配合物或鐵氰化物配合物。