相關(guān)申請的交叉參考

本申請要求2011年12月23日提交的美國臨時(shí)申請系列號61/580,139的優(yōu)先權(quán)。在先申請的公開內(nèi)容被認(rèn)為是本申請公開的部分(且通過引用納入本文)。

有關(guān)聯(lián)邦資助的研究的聲明

本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的hl036634和hl076611下由政府資助完成。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。

背景

1.技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及評價(jià)腎結(jié)構(gòu)改變(如腎纖維化)的方法和材料以及評價(jià)后果的方法和材料。例如，本發(fā)明涉及使用尿液c型利尿鈉肽(cnp)的水平(如尿液與血漿cnp的比率)或血漿cnp的水平以確定哺乳動(dòng)物是否正發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、足細(xì)胞腫脹和足突消失)的方法和材料。本發(fā)明還涉及使用尿液或血漿cnp(可包括六種分子cnp形式)水平鑒定心力衰竭患者的方法和材料，所述患者發(fā)生不良結(jié)果的幾率增加且可能罹患已知與腎臟相關(guān)的疾病，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征和慢性腎疾病。

2.背景信息

c型利尿鈉肽(cnp)是利尿鈉肽家族中的一部分，在腎臟及內(nèi)皮中生成并可在血漿和尿液中檢測到。首先合成前體103個(gè)氨基酸(aa)的蛋白質(zhì)procnp(aa1-103)，然后被細(xì)胞內(nèi)內(nèi)切蛋白酶弗林蛋白酶切割成cnp-53(aa51-103)和nt-procnp(aa1-50)。由一未知酶催化的進(jìn)一步下游加工對將cnp-53切割成主要的生物活性形式cnp-22(aa82-103)及其氨基端nt-cnp-53(51-81)。

通過激活利尿鈉肽受體b(npr-b，也被稱作鳥苷酸環(huán)化酶受體b(gc-b))并生成第二信使3’，5’-環(huán)鳥苷一磷酸(cgmp)，cnp擁有強(qiáng)大的抗纖維化和抗增殖特性。cnp含有有限的排鈉利尿和利尿活性。

概述

本發(fā)明提供了涉及評價(jià)腎結(jié)構(gòu)改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、足細(xì)胞腫脹和足突消失)的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp(如尿液與血漿cnp的比率)和/或血漿cnp的水平以確定哺乳動(dòng)物是否正在或?qū)⒁l(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變(如腎纖維化、腎小球基底增厚、系膜基質(zhì)膨脹、足細(xì)胞腫脹和足突消失)的方法和材料。通過評價(jià)尿液或血漿cnp水平(如尿液與血漿cnp的比率)確定人類患者是否正在或?qū)⒁l(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變能夠有助于在癥狀和疾病出現(xiàn)前鑒定臨床前腎結(jié)構(gòu)改變的人，從而啟動(dòng)設(shè)計(jì)用于防止慢性腎疾病發(fā)展的策略。

本發(fā)明還提供了評價(jià)心力衰竭結(jié)果的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液或血漿cnp和/或其六個(gè)可能的分子形式(圖8)鑒定發(fā)生不良結(jié)果幾率增加的人的方法和材料。至少部分基于尿液cnp水平上升和/或血漿cnp水平降低對發(fā)生不良結(jié)果幾率增加的患者的鑒定能夠幫助醫(yī)生和患者做出適當(dāng)?shù)闹委煕Q定。

總的來說，本發(fā)明的一個(gè)方面描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高，尿液cnp與血漿cnp的比率升高表明哺乳動(dòng)物腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變，且尿液cnp與血漿cnp的比率未升高表明哺乳動(dòng)物未發(fā)生且不會(huì)發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率是否升高，尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高表明哺乳動(dòng)物腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變，且不存在尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高表明哺乳動(dòng)物未發(fā)生且不會(huì)發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測哺乳動(dòng)物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結(jié)果將哺乳動(dòng)物鑒定為存在腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測哺乳動(dòng)物的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結(jié)果將哺乳動(dòng)物鑒定為存在腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)結(jié)果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動(dòng)物是否患有一種會(huì)使尿液cnp水平升高的疾病，尿液cnp水平升高表明哺乳動(dòng)物可能發(fā)生不良結(jié)果，且尿液cnp水平未升高表明哺乳動(dòng)物不可能發(fā)生不良結(jié)果。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結(jié)果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)結(jié)果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)檢測患病哺乳動(dòng)物的尿液cnp是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結(jié)果將哺乳動(dòng)物鑒定為可能發(fā)生不良結(jié)果。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結(jié)果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)以檢測哺乳動(dòng)物中尿液cnp與血漿cnp的比率升高，以及(b)將哺乳動(dòng)物鑒定為存在腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)腎結(jié)構(gòu)的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)以檢測哺乳動(dòng)物中尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率升高，以及(b)將哺乳動(dòng)物鑒定為存在腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述腎結(jié)構(gòu)改變可以包括腎纖維化。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp-22與血漿cnp-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)結(jié)果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)以檢測患病哺乳動(dòng)物中尿液cnp水平是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結(jié)果將哺乳動(dòng)物鑒定為可能發(fā)生不良結(jié)果。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。所述不良結(jié)果可以是死亡、住院治療、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化或透析。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp53/天。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)哺乳動(dòng)物是否存在死亡或心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：確定哺乳動(dòng)物的血漿cnp-22水平是否升高，血漿水平升高表明該哺乳動(dòng)物有可能比該水平未升高的同等哺乳動(dòng)物早發(fā)生死亡或心肌梗塞，且血漿水平未升高表明該哺乳動(dòng)物有可能比該水平升高的同等哺乳動(dòng)物晚發(fā)生死亡或心肌梗塞。所述哺乳動(dòng)物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種評價(jià)哺乳動(dòng)物是否存在死亡或心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)使用抗-cnp抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)以檢測哺乳動(dòng)物中血漿cnp-22水平是否升高，以及(b)至少部分基于檢測結(jié)果將哺乳動(dòng)物鑒定為可能發(fā)生死亡或心肌梗塞。所述哺乳動(dòng)物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。所述方法可包括將哺乳動(dòng)物鑒定為可能比該水平未升高的同等哺乳動(dòng)物早發(fā)生死亡或心肌梗塞。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種治療腎結(jié)構(gòu)改變風(fēng)險(xiǎn)升高的哺乳動(dòng)物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp與血漿cnp的比率升高，(b)監(jiān)測哺乳動(dòng)物是否存在腎結(jié)構(gòu)改變的風(fēng)險(xiǎn)因素，以及(c)指導(dǎo)給予哺乳動(dòng)物治療劑以減輕腎結(jié)構(gòu)改變的癥狀。所述哺乳動(dòng)物可以是人。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于12,000pg/天比16pg/ml。升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以高于13,200pg/天比18pg/ml。所述風(fēng)險(xiǎn)因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種治療不良結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)升高的哺乳動(dòng)物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp水平升高，(b)監(jiān)測哺乳動(dòng)物是否存在不良結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)因素，以及(c)指導(dǎo)給予哺乳動(dòng)物治療劑以降低不良結(jié)果發(fā)生的可能性。所述哺乳動(dòng)物可以是人。所述尿液cnp可以是尿液nt-cnp-53。升高的水平可以高于36,000pg的nt-cnp-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的nt-cnp-53/天。所述風(fēng)險(xiǎn)因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了一種治療心肌梗塞風(fēng)險(xiǎn)升高的哺乳動(dòng)物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步驟組成：(a)確定哺乳動(dòng)物的血漿cnp-22水平升高，(b)監(jiān)測哺乳動(dòng)物是否存在心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)因素，以及(c)指導(dǎo)給予哺乳動(dòng)物治療劑以降低心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。所述哺乳動(dòng)物可以是人。升高的水平可以高于14pg/ml。升高的水平可以高于16pg/ml。所述風(fēng)險(xiǎn)因素可以選自由以下因素組成的組：年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和糖尿病。所述治療劑可以是ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽。

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以采用類似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書(包括定義在內(nèi))為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例都僅是說明性的，并不意在構(gòu)成限制。

從下文的詳述和權(quán)利要求中能夠很容易地了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1.(a)天狼猩紅染色在20x物鏡放大下的代表性組織學(xué)圖像和定量(b)2、11和20個(gè)月齡費(fèi)歇爾大鼠的腎皮質(zhì)纖維化的20x物鏡放大下的代表性組織學(xué)圖像。數(shù)值為平均值±se。所有年齡組中n＝7。*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月。

圖2.(a)天狼猩紅染色在20x物鏡放大下的代表性組織學(xué)圖像和定量(b)2、11和20個(gè)月齡費(fèi)歇爾大鼠的腎髓質(zhì)纖維化的20x物鏡放大下代表性組織學(xué)圖像。數(shù)值為平均值±se。所有年齡組中n＝7。*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月。

圖3.來自2個(gè)月(a)、11個(gè)月(b)和20個(gè)月(c)齡費(fèi)歇爾大鼠的腎小球在8000x放大下的代表性電子顯微鏡圖。

圖4.來自2、11和20個(gè)月齡費(fèi)歇爾大鼠中腎小球基底增厚的定量。數(shù)值為平均值±se。所有年齡組中n＝5。*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月。

圖5.來自2、11和20個(gè)月齡費(fèi)歇爾大鼠中腎皮質(zhì)和髓質(zhì)cnp的免疫組化定位在20x物鏡放大下的代表性圖像。

圖6.在2、11和20個(gè)月齡費(fèi)歇爾大鼠之間血漿cnp(a)、尿液cnp排泄(b)、尿液與血漿cnp的比率(c)和蛋白尿(d)的變化。數(shù)值為平均值±se。所有年齡組中n＝10。*p<0.05相對于2個(gè)月，相對于11個(gè)月。

圖7.尿液cnp排泄與腎皮質(zhì)(a)和髓質(zhì)(b)纖維化、以及尿液與血漿cnp的比率與腎皮質(zhì)(c)和髓質(zhì)(d)纖維化之間的關(guān)聯(lián)。

圖8為cnp分子形式的示意圖。

圖9為cnp分子形式的氨基酸序列表。

圖10.來自年輕人類供體(a-c)和年長人類供體(d-f)的腎組織內(nèi)cnp免疫組化定位在20x物鏡放大下的圖像。陰性對照(g)。

圖11.腎小球基底膜(gbm)厚度與尿液cnp排泄之間(a)以及gbm厚度與尿液與血漿cnp的比率之間(b)的關(guān)聯(lián)。

圖12.adhf患者(hhf)對比對照組中尿液kim-1排泄。帶有24小時(shí)kim-1排泄數(shù)值的中位數(shù)和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)的異常值盒狀圖。

圖13a-c。nt-cnp-53排泄和臨床結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)：(a)死亡率，(b)首次非選擇性(所有原因)再入院治療的時(shí)間/死亡，(c)首次非選擇性心血管再入院治療的時(shí)間/死亡。帶有24小時(shí)nt-cnp-53排泄數(shù)值的中位數(shù)和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)的異常值盒狀圖(轉(zhuǎn)化成自然對數(shù)數(shù)據(jù))。

圖14a-c。adhf中主要結(jié)果(死亡率)形成的cnp分子的尿液排泄。顯示adhf中24小時(shí)尿液的(a)cnp22、(b)cnp53和(c)nt-cnp53排泄數(shù)值的中位數(shù)和四分位差(iqr；盒)以及1.5*iqr(誤差線)相對于死亡率的異常值盒狀圖。

圖15a-b。普通人群中根據(jù)血漿cnp-22水平四分位數(shù)的死亡(a)和心肌梗塞(mi；b)的卡普蘭-邁耶曲線。cnp-22q1為2.0至10.1pg/ml；cnp-22q2為10.2至13.1pg/ml；cnp-22q3為13.2至16.7pg/ml；且cnp-22q4為16.8至265.0pg/ml。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了涉及評價(jià)腎結(jié)構(gòu)改變(如腎纖維化)的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp水平(例如尿液與血漿cnp的比率)和/或血漿cnp水平以確定哺乳動(dòng)物是否腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變的方法和材料。如本文所述，存在尿液cnp水平升高、血漿cnp水平降低和/或尿液與血漿cnp的比率升高表明哺乳動(dòng)物腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。腎結(jié)構(gòu)改變的示例包括但不限于腎纖維化、腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)膨脹、足細(xì)胞腫脹和足突消失。本文所提供的方法和材料可用于評價(jià)任何適當(dāng)哺乳動(dòng)物中的腎結(jié)構(gòu)改變，所述哺乳動(dòng)物包括但不限于人類、猴、馬、奶牛、綿羊、山羊、小鼠和大鼠。

人類cnp的六種分子形式的氨基酸序列列于圖8和9。

本文中相對于血漿或尿液cnp水平(或cnp的一種特定分子形式，如cnp-53)所用術(shù)語“升高的水平”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個(gè)健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體)中血漿或尿液水平中位數(shù)的任意水平。在一些情況下，血漿cnp(如血漿cnp-22)升高的水平可以是高于16pg/ml的任意水平。在一些情況下，尿液cnp(如尿液cnp-22)升高的水平可以是高于12,000pg/天的任意水平。

本文中相對于尿液cnp與血漿cnp的比率所用術(shù)語“升高”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個(gè)健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體)中尿液cnp與血漿cnp的比率平均值的任意比率水平。在一些情況下，升高的尿液cnp與血漿cnp的比率可以是高于12,000pg/天的尿液cnp比16pg/ml血漿cnp的一個(gè)比率。在一些情況下，可使用血漿cnp與尿液cnp的比率替代尿液cnp與血漿cnp的比率。

在一些情況下，血漿cnp水平降低可表明哺乳動(dòng)物腎結(jié)構(gòu)改變或有會(huì)發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生不良結(jié)果。本文中相對于血漿cnp水平所用術(shù)語“降低的水平”表示低于沒有腎疾病的健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個(gè)健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體)中血漿cnp水平中位數(shù)的任意水平。在一些情況下，降低的血漿cnp水平可以是低于10pg/ml的任意水平。

在一些情況下，存在血漿cnp水平降低、尿液cnp水平升高和血漿nt-probnp水平升高可表明哺乳動(dòng)物腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變或可能發(fā)生不良結(jié)果。本文中相對于血漿nt-probnp水平所用術(shù)語“升高的水平”表示高于沒有腎疾病的健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個(gè)健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體)中血漿水平中位數(shù)的任意水平。在一些情況下，血漿nt-probnp升高的水平可以是高于450pg/ml的任意水平。

可使用任意適當(dāng)方法以確定尿液cnp水平、血漿cnp水平、尿液cnp與血漿cnp的比率、血漿nt-probnp水平或血漿cnp與尿液cnp的比率。例如，可使用多肽檢測法(如免疫試驗(yàn)(如elisa或放射免疫試驗(yàn)))和質(zhì)譜確定血漿或尿液樣品中的cnp水平。在一些情況下，可使用放射免疫試驗(yàn)確定尿液cnp與血漿cnp的比率。

本發(fā)明還提供了涉及評價(jià)結(jié)果的方法和材料。例如，本發(fā)明提供了使用尿液cnp或其六種可能的分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平以確定哺乳動(dòng)物是否可能發(fā)生不良結(jié)果的方法和材料。如本文所述，存在尿液cnp水平升高表明哺乳動(dòng)物可能發(fā)生不良結(jié)果。不良結(jié)果的示例包括但不限于死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化和透析。本文所提供的方法和材料可用于評價(jià)任何適當(dāng)哺乳動(dòng)物中的結(jié)果，所述哺乳動(dòng)物包括但不限于人類、猴、馬、奶牛、綿羊和山羊。

在一些情況下，本文中相對于尿液nt-cnp-53水平所用術(shù)語“升高的水平”表示高于健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體(如含有10、20、30、40、50、100或500個(gè)健康哺乳動(dòng)物的年齡匹配隨機(jī)群體)中尿液nt-cnp-53水平中位數(shù)的任意水平，所述健康哺乳動(dòng)物沒有其他共病病史，如心力衰竭、高血壓、糖尿病、代謝綜合征或慢性腎臟疾病。在一些情況下，升高的尿液nt-cnp-53水平可以是高于36,000pg/天的任意水平。

本發(fā)明還提供了幫助醫(yī)療或研究專家確定哺乳動(dòng)物是否腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變的方法和材料以及幫助醫(yī)療或研究專業(yè)人員確定哺乳動(dòng)物是否可能發(fā)生不良結(jié)果的方法和材料。醫(yī)療專業(yè)人員可以是例如醫(yī)生、護(hù)士、醫(yī)療實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和藥劑師。研究專業(yè)人員可以是例如研究負(fù)責(zé)人、研究技術(shù)員、博士后研究員或研究生?？梢酝ㄟ^(1)確定尿液cnp水平、血漿cnp水平、尿液cnp與血漿cnp的比率或血漿cnp與尿液cnp的比率，以及(2)將上述水平和比率的信息與專業(yè)人員交流的方式幫助專業(yè)人員確定哺乳動(dòng)物是否腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。可以通過(1)確定尿液cnp水平，以及(2)將上述水平的信息與專業(yè)人員交流的方式幫助專業(yè)人員確定哺乳動(dòng)物是否可能發(fā)生不良結(jié)果。

可使用任何方法與其他人員(如專業(yè)人員)交流信息。例如，可以將信息直接或間接地提供給專業(yè)人員。此外，可使用任何形式的交流方式以交流信息。例如，可使用郵件、電子郵件、電話和面對面交談。也可以通過將這些信息電子化的方式將信息傳遞給專業(yè)人員來與專業(yè)人員交流信息。例如可以通過將信息置于計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫中以使專業(yè)人員能夠獲得該信息，從而實(shí)現(xiàn)與專業(yè)人員交流信息。此外，信息可以傳遞給醫(yī)院、診所、或者作為所述專業(yè)人員媒介的研究機(jī)構(gòu)。

本發(fā)明還提供了治療腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變的哺乳動(dòng)物的方法和材料。例如，可以評價(jià)哺乳動(dòng)物以確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp與血漿cnp的比率是否升高。如本文所述，尿液cnp與血漿cnp的比率升高的哺乳動(dòng)物可能腎結(jié)構(gòu)改變或有可能發(fā)生腎結(jié)構(gòu)改變。一旦哺乳動(dòng)物被鑒定為尿液cnp與血漿cnp的比率升高，可監(jiān)測該哺乳動(dòng)物以確定是否存在腎結(jié)構(gòu)改變的一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素。例如，可監(jiān)測或評價(jià)該哺乳動(dòng)物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和/或糖尿病。一旦鑒定存在尿液cnp與血漿cnp的比率升高和一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動(dòng)物，所述治療劑被設(shè)計(jì)用于緩解或抵消腎結(jié)構(gòu)改變的癥狀。例如，可使用ace抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑(arb)、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽治療尿液cnp與血漿cnp的比率升高和高血壓的哺乳動(dòng)物以緩解腎結(jié)構(gòu)改變的癥狀。在一些情況下，可指導(dǎo)尿液cnp與血漿cnp的比率升高且?guī)в幸豁?xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物使用一種或多種治療劑進(jìn)行自我治療，所述治療劑被設(shè)計(jì)用于緩解或抵消腎結(jié)構(gòu)改變的癥狀。

本發(fā)明還提供了治療可能發(fā)生不良結(jié)果(如死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、腎功能惡化、心臟功能惡化和透析)的哺乳動(dòng)物的方法和材料。例如，可對哺乳動(dòng)物進(jìn)行評價(jià)以確定哺乳動(dòng)物的尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平是否升高。如本文所述，尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高的哺乳動(dòng)物可能發(fā)生不良結(jié)果。一旦哺乳動(dòng)物被鑒定為尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高，則可監(jiān)測該哺乳動(dòng)物以確定是否存在不良結(jié)果的一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素。例如，可監(jiān)測或評價(jià)該哺乳動(dòng)物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和/或糖尿病。一旦鑒定存在尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高和一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動(dòng)物，所述治療劑被設(shè)計(jì)用來降低不良結(jié)果發(fā)生的可能性。例如，可使用ace抑制劑、arb、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽治療存在尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高和高血壓的哺乳動(dòng)物以降低不良結(jié)果發(fā)生的可能性。在一些情況下，可指導(dǎo)尿液cnp或其六種可能分子形式(如cnp-53或nt-cnp-53)的水平升高且有一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物使用一種或多種治療劑進(jìn)行自我治療，所述治療劑被設(shè)計(jì)用來降低不良結(jié)果發(fā)生的可能性。

本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物的方法和材料。例如，可以評價(jià)哺乳動(dòng)物以確定哺乳動(dòng)物的血漿cnp-22水平是否升高。如本文所述，血漿cnp-22水平升高的哺乳動(dòng)物遭受死亡或心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)上升。一旦哺乳動(dòng)物被鑒定為血漿cnp-22水平升高，可監(jiān)測該哺乳動(dòng)物以確定是否存在死亡或心肌梗塞的一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素。例如，可監(jiān)測或評價(jià)該哺乳動(dòng)物以確定是否存在年齡因素、高血壓、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性別、體重指數(shù)升高、膽固醇水平升高、吸煙習(xí)慣和/或糖尿病。一旦鑒定到血漿cnp-22水平升高且有一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物，可使用一種或多種治療劑治療該哺乳動(dòng)物，所述治療劑被設(shè)計(jì)用來降低哺乳動(dòng)物遭受死亡或心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。例如，可使用ace抑制劑、arb、醛固酮拮抗劑、抑制素、天然利尿鈉肽或設(shè)計(jì)利尿鈉肽治療血漿cnp-22水平升高且膽固醇水平升高的哺乳動(dòng)物以降低該哺乳動(dòng)物遭受死亡或心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。在一些情況下，可指導(dǎo)血漿cnp-22水平升高且有一項(xiàng)或多項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)因素的哺乳動(dòng)物使用一種或多種治療劑進(jìn)行自我治療，所述治療劑被設(shè)計(jì)用來降低哺乳動(dòng)物遭受死亡或心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。

以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1-使用尿液cnp排泄作為衰老期間腎纖維化的生物標(biāo)記

動(dòng)物

研究在2、11和20個(gè)月齡雄性費(fèi)歇爾大鼠中進(jìn)行(哈倫實(shí)驗(yàn)室公司(harlanlaboratories，inc.)，威斯康星州麥迪遜，每個(gè)年齡組n＝8-10，另有說明者除外)。實(shí)驗(yàn)性研究按照動(dòng)物福利法和梅約臨床機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(mayoclinicinstitutionalanimalcareandusecommittee)的批準(zhǔn)進(jìn)行。

人類腎活檢組織

人類腎組織獲得自捐獻(xiàn)腎臟時(shí)健康生活的腎供體的細(xì)針抽吸活檢樣本，如他處所述(rule等，ann.intern.med.，152：561-567(2010))。本研究中檢測了總共六份石蠟包埋腎活檢樣本。年輕組由三名平均年齡為19歲(年齡范圍18至20歲)的女性供體組成，年老組由三名71歲的女性供體組成。

24小時(shí)尿液收集

大鼠置于代謝籠中，能夠自由進(jìn)食和飲水并用24小時(shí)時(shí)間使之適應(yīng)環(huán)境。適應(yīng)期后，隨即用24小時(shí)收集尿液用于蛋白尿和cnp評價(jià)。使用鄰苯三酚紅染色結(jié)合試驗(yàn)測量24小時(shí)尿液樣品中的尿蛋白排泄。

急性血壓研究、腎小球過濾速率和血漿收集

麻醉大鼠(氧氣中1.5％異氟烷)，將pe-50管置于頸動(dòng)脈以使用cardiosoftpro軟件(sonometrics公司，安大略省倫敦)采集血壓(bp)并取血樣。將插管插入膀胱進(jìn)行尿液收集。將pe-50管插入頸靜脈并持續(xù)注入含2％菊粉的生理鹽水(西格瑪公司(sigma)，密蘇里州圣路易斯)。60分鐘平衡后，進(jìn)行廓清研究。廓清研究持續(xù)60分鐘，在廓清研究結(jié)束時(shí)同血樣一起收集尿液以計(jì)算菊粉廓清中的gfr并用于測量血漿cnp。從頸動(dòng)脈中收集血液并置于冰上的edta管中(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。立即將血液在4℃下2,500rpm離心10分鐘，血漿儲(chǔ)存于聚苯乙烯管，在-80℃保存以備后續(xù)使用。使用用于gfr分析的蒽酮法測量菊粉濃度，如他處所述(davidson和sackner，j.lab.clin.med.，62：351-356(1963))。

大鼠腎組織

急性研究后，完整移除大鼠腎臟，隨后將其分成幾部分。將腎組織的橫截面保存于10％福爾馬林中用于纖維化和cnp的組織學(xué)分析，較小的方形部分保存于2.5％戊二醛中用于電子顯微鏡(em)分析。

纖維化的組織學(xué)分析

將固定后的大鼠腎組織(n＝7)脫水并包埋于石蠟中，切成厚度為4μm的切片。使用天狼猩紅對纖維化的膠原蛋白和延伸進(jìn)行染色。使用axioplaniiks400顯微鏡(卡爾蔡司公司(carlzeiss，inc)，德國)在每張切片中捕捉至少4張隨機(jī)選擇的圖像，使用20x物鏡并使用ks400軟件確定纖維化區(qū)域占組織總面積的百分比。

電子顯微鏡分析

將2.5％戊二醛中固定的大鼠腎組織脫水并包埋于樹脂模具中。根據(jù)em核心設(shè)備程序切割超薄切片。使用jem-1400透射電子顯微鏡在5000x和8000x放大下對腎小球進(jìn)行成像。

腎小球基底膜厚度測量

在每個(gè)年齡組(n＝5)的大鼠中使用5000x放大捕捉腎小球em圖像。使用應(yīng)用數(shù)字顯微照片(digitalmicrograph)(gatan公司，加利福尼亞州普萊森頓)測量gbm的厚度。對于每只大鼠，由一名有經(jīng)驗(yàn)的em技術(shù)員測量20次并使用excel形態(tài)測量宏處理數(shù)據(jù)，給出以納米(nm)為單位的平均厚度。

血漿和尿液cnp

使用來自于菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗(yàn)試劑盒和與大鼠cnp-22具有完全交叉反應(yīng)性的抗-人cnp-22抗體確定血漿和尿液cnp-22的方法如他處所述(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。使用c-18bondelut固相萃取筒提取一毫升血漿。使用4ml100％甲醇和4ml水清洗筒后，加入血漿并清洗筒。在savant快速真空濃縮器中濃縮洗脫液，并用300μl試驗(yàn)緩沖液重懸沉淀。將100μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與100μl抗-人cnp抗體在4℃下孵育。18小時(shí)后，加入100μl(10,000計(jì)數(shù))i¹²⁵標(biāo)記的cnp并在4℃下孵育18小時(shí)。隨后，在所有樣品中加入二抗以使游離和結(jié)合的部分分離，并對樣品進(jìn)行離心。吸出游離的部分并在γ計(jì)數(shù)器上對結(jié)合的部分進(jìn)行計(jì)數(shù)。生成并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算未知樣品的濃度，其報(bào)告單位為pg/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.5至128pg，檢測的下限為0.5pg。試驗(yàn)間和試驗(yàn)內(nèi)差異分別為11％和5.2％?；厥章蕿?2±6％。與anp、bnp、內(nèi)皮素和腎上腺髓質(zhì)素的交叉反應(yīng)性＜1％，與cnp-53的交叉反應(yīng)性為97％。

cnp免疫組化

評價(jià)是否存在腎臟cnp免疫組化的方法如他處所述(stingo等，am.j.phys.，263：h1318-1321(1992))。簡單地說，將石蠟包埋的腎組織切片在60℃加熱爐中孵育2小時(shí)，隨后使用已有的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行脫石蠟。脫石蠟后，用甲醇中0.6％過氧化氫室溫下孵育切片20分鐘以限制內(nèi)源性過氧化氫酶活性，隨后在加入一抗前使用5％正常山羊血清封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。將切片置于保濕室，以1∶500的稀釋比例加入一抗(兔抗人cnp-22，菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)，加利福尼亞州芒廷維尤)，室溫反應(yīng)18-24小時(shí)。使用正常兔血清處理對照切片。將切片與共價(jià)連接了辣根過氧化物酶的山羊抗兔igg以及過氧化物酶的底物3-氨基-9-乙基-咔唑孵育，并使用蘇木精反染以強(qiáng)化核的細(xì)節(jié)。隨后由一名不知道年齡分組的腎臟病理學(xué)家觀察并解釋染色的切片。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果表示為平均值±se。使用anova及隨后的newman-keuls多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較。進(jìn)行皮爾森相關(guān)以計(jì)算尿液cnp排泄和腎纖維化以及gfr之間和尿液與血漿cnp的比率和腎纖維化之間的關(guān)聯(lián)。上述計(jì)算使用graphpadprism軟件(圖形軟件有限公司(graphpadsoftware)，加利福尼亞州拉由拉市)。統(tǒng)計(jì)的顯著性接受為p＜0.05。

結(jié)果

與年齡相關(guān)的人體測量、腎臟特征和血液動(dòng)力學(xué)確定了體重(bw)、腎臟總重量(tkw)、血漿肌酸酐、gfr以及平均動(dòng)脈壓(map)水平(表1)。相比于2個(gè)月的組，11個(gè)月時(shí)bw和tkw有顯著增加，在20個(gè)月時(shí)持續(xù)。當(dāng)使用bw對tkw進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，tkw∶bw比率在11和20個(gè)月時(shí)出現(xiàn)顯著下降。此外，相比于2個(gè)月，11和20個(gè)月時(shí)血漿肌酸酐水平顯著上升，11個(gè)月時(shí)gfr存在下降的趨勢，在20個(gè)月時(shí)持續(xù)。map僅在20個(gè)月時(shí)出現(xiàn)顯著上升。

表1.老化費(fèi)歇爾大鼠中體重、腎臟特征和血壓匯總。

bw＝體重；tkw＝腎臟總重量；cr＝血漿肌酸酐；gfr＝腎小球過濾速率；map＝平均動(dòng)脈壓。數(shù)值為平均值±se。所有年齡組中n＝10。*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月。

腎纖維化和腎小球超結(jié)構(gòu)

獲得了使用天狼猩紅對腎皮質(zhì)(圖1a)和髓質(zhì)(圖2a)進(jìn)行染色的代表性顯微照片。這些顯微照片提供了對纖維膠原沉積的估計(jì)。具體而言，隨著年齡的增長，皮質(zhì)(圖1b)和髓質(zhì)(圖2b)間隙的膠原染色出現(xiàn)明顯且逐步的增長。此外，還獲得了腎小球的代表性電子顯微照片(圖3)。在2個(gè)月時(shí)(圖3a)，內(nèi)臟表皮細(xì)胞的足突是完整的。11個(gè)月時(shí)(圖3b)，系膜區(qū)域與基質(zhì)一起溫和膨脹，且相比于2個(gè)月時(shí)毛細(xì)血管袢基膜呈現(xiàn)溫和增厚。20個(gè)月時(shí)(圖3c)，系膜基質(zhì)出現(xiàn)彌漫性膨脹。相比于2和11個(gè)月時(shí)，毛細(xì)血管袢基膜增厚且內(nèi)臟表皮細(xì)胞的足突出現(xiàn)集中性消失。對gbm的厚度進(jìn)行了形態(tài)測量分析(圖4)。隨著年齡的增長，毛細(xì)血管袢基膜逐步且明顯地增厚，20個(gè)月時(shí)基膜的厚度幾乎達(dá)到了2個(gè)月時(shí)基膜厚度的3倍。

腎cnp的免疫組化定位

評估了2、11和20個(gè)月齡的費(fèi)歇爾大鼠中腎皮質(zhì)(左圖)和髓質(zhì)(右圖)內(nèi)cnp的免疫組化定位(圖5)。2個(gè)月時(shí)，近端腎管沒有明顯染色，cnp的免疫染色位于腎皮質(zhì)的遠(yuǎn)端腎管中。在11個(gè)月時(shí)，腎皮質(zhì)中cnp的免疫染色主要位于遠(yuǎn)端腎管，近端腎管中只有微弱染色。在20個(gè)月時(shí)，可在腎皮質(zhì)的遠(yuǎn)端腎管內(nèi)和近端腎管的集中觀察到強(qiáng)烈的cnp免疫染色。在腎髓質(zhì)的遠(yuǎn)端腎管中也可觀察到強(qiáng)烈的cnp免疫染色，且不隨年齡出現(xiàn)顯著變化。

此外，圖10顯示了在來自健康人類腎臟供體的年輕(a-c)和年老(d-f)活檢樣本中cnp的免疫組化定位。在從年輕腎臟供體獲得的活檢樣本中，cnp染色主要位于遠(yuǎn)端腎管，在近端腎管中可觀察到相對較弱且集中的染色。在從年老腎臟供體(d-f)獲得的活檢樣本中，在遠(yuǎn)端和近端腎管中均可觀察到強(qiáng)烈的cnp染色。

尿液和血漿cnp、尿液與血漿cnp的比率和蛋白尿

評估了隨年齡增長血漿和尿液cnp的變化(圖6)。在三個(gè)年齡組間觀察到血漿cnp明顯且逐步的降低(2個(gè)月平均值±se：29±3pg/ml；11個(gè)月平均值±se：20±1*pg/ml；20個(gè)月平均值±se：9±1*pg/ml；*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月)(圖6a)。相反地，11個(gè)月時(shí)尿液cnp排泄出現(xiàn)顯著增長，在20個(gè)月時(shí)保持上升(2個(gè)月平均值±se：64±4pg/天；11個(gè)月平均值±se：110±6*pg/天；20個(gè)月平均值±se：103±7*pg/天；*p＜0.05相對于2個(gè)月)(圖6b)。此外，尿液與血漿cnp的比率也出現(xiàn)了明顯且逐步的增加(圖6c：2個(gè)月平均值±se：2.2±0.2pg/天/pg/ml；11個(gè)月平均值±se：5.4±0.3*pg/天/pg/ml；20個(gè)月平均值±se：11.7±1.0*pg/天/pg/ml；*p＜0.05相對于2個(gè)月，p＜0.05相對于11個(gè)月)。僅在20個(gè)月時(shí)觀察到蛋白尿的顯著升高(圖6d)。

尿液cnp排泄和尿液血漿cnp的比率之間的關(guān)聯(lián)

cnp和腎皮質(zhì)纖維化之間(圖7a；n＝21，r＝0.54，p＝0.01)以及cnp和腎髓質(zhì)纖維化之間(圖7b；n＝21，r＝0.65，p＝0.001)存在正相關(guān)關(guān)系。此外，尿液與血漿cnp的比率和腎皮質(zhì)纖維化(圖7c；n＝21，r＝0.83，p＝0.0001)之間之間，以及尿液與血漿cnp的比率和腎髓質(zhì)纖維化(圖7d；n＝21，r＝0.77，p＝0.0001)之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系。尿液cnp和gfr之間不存在關(guān)聯(lián)(n＝30，r＝0.01，p＝0.97)。圖11顯示了gbm厚度、尿液cnp(圖11a；n＝15，r＝0.77，p＝0.0008)和尿液與血漿cnp的比率(圖11b；n＝15，r＝0.95，p＝0.0001)之間強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系。

本文所提供的結(jié)果證明衰老期間尿液cnp排泄增加，且尿液cnp排泄的增加與腎纖維化及gbm增厚強(qiáng)烈相關(guān)，后者的出現(xiàn)早于明顯的蛋白尿或bp升高。隨著腎臟老化可觀察到尿液cnp排泄的增加，并與尿液與血漿cnp的比率顯著增加和循環(huán)cnp及腎功能的下降同時(shí)出現(xiàn)。這些結(jié)果證明尿液cnp及其與血漿cnp的比率是衰老期間臨床跡象出現(xiàn)前所發(fā)生的早期腎結(jié)構(gòu)改變的生物標(biāo)記。

實(shí)施例2-cnp是一種在住院急性失代償性心力衰竭(adhf)中有預(yù)后價(jià)值且獨(dú)立于腎小球過濾速率和nt-probnp的尿液生物標(biāo)記

患者群體

共研究了60名adhf(急性失代償性心力衰竭)患者，對照組包括20名健康對象。adhf患者接受預(yù)期鑒定并通過連續(xù)入院的登記簿招募。對于新發(fā)生或已建立的慢性hf，準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)均為與弗雷明漢標(biāo)準(zhǔn)一致的收縮hf臨床診斷(mckee等，n.engl.j.med.，285：1441-6(1971))，通過超聲心動(dòng)描記術(shù)中左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)的降低(＜50％)加以確認(rèn)。為使研究群體反映正常臨床實(shí)踐的異質(zhì)性，對于適當(dāng)?shù)哪蛞荷飿?biāo)記而言，單一的排除標(biāo)準(zhǔn)是不完整或不正確的尿液收集?；诖伺懦藘擅鸻dhf患者，在adhf組中總共剩下58名同意的連續(xù)患者。對所有患者進(jìn)行基線歷史評價(jià)、身體檢查和經(jīng)胸壁超聲心動(dòng)圖，作為部分常規(guī)臨床護(hù)理。在入院后72小時(shí)內(nèi)取得用于cnp和nt-probnp測量的血漿樣品并進(jìn)行24小時(shí)尿液收集。在冰上將尿液樣品收集于醋酸中(30ml1∶1醋酸；17.4m)。在定時(shí)的尿液收集(平均值22.9±4小時(shí))結(jié)束時(shí)，記錄總量并將樣品分至各個(gè)容器，凍存于-80℃至分析。對于初級分析，gfr被定義為24小時(shí)肌酸酐清除。重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果以與腎病膳食改良(mdrd)中估計(jì)的gfr一致。

對照對象從健康志愿者群體中招募。所有人都是不吸煙者且沒有心血管或系統(tǒng)疾病病史。招募后即對用于cnp和nt-probnp測量的血漿樣品進(jìn)行取樣并進(jìn)行24小時(shí)尿液收集。

尿液生物標(biāo)記測定

ngal和kim-1

根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(elisa，r&d系統(tǒng)公司(r&dsystems))，通過酶連免疫試驗(yàn)測量尿液中ngal和kim-1的濃度。ngal的最低可檢測劑量為0.012ng/ml，而kim-1的最低可檢測劑量為0.009ng/ml。兩個(gè)試驗(yàn)的試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間變異系數(shù)分別為＜5％和＜8％。ngal被認(rèn)為能與mmp9形成復(fù)合物；重組人類mmp-9/ngal復(fù)合物在所用試驗(yàn)中表現(xiàn)出0.3％的交叉反應(yīng)性。在kim試驗(yàn)中沒有明顯的交叉反應(yīng)性或干擾。

cnp-22(aa82-103)

可使用來自菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗(yàn)試劑盒以及能夠檢測人類cnp-22的抗體確定尿液cnp-22，如他處所述(sangaralingham等，am.j.physiol.renalphysiol.，301：f943-52(2011))。標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.5-128pg，檢測的下限為0.5pg。試驗(yàn)間和試驗(yàn)內(nèi)差異分別為11％和5％?；厥章蕿?5％。與anp、bnp、內(nèi)皮素和nt-cnp53的交叉反應(yīng)性為0％，與cnp-53的交叉反應(yīng)性為59％。

cnp-53(aa51-103)和nt-cnp53(aa51-81)

與cnp-22相似，可使用來自于菲尼克斯制藥有限公司(phoenixpharmaceutical)(加利福尼亞州芒廷維尤)的市售非平衡放射免疫試驗(yàn)試劑盒以及能夠檢測人類cnp-53和僅當(dāng)cnp-53與環(huán)結(jié)構(gòu)分離時(shí)其氨基端起始的前29個(gè)氨基酸(nt-cnp-53)的抗體確定尿液cnp-53和nt-cnp-53。生成并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算未知樣品的濃度，其報(bào)告單位為pg/ml。對于cnp-53，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.5-128pg。試驗(yàn)間和試驗(yàn)內(nèi)差異分別為8％和7％?；厥章蕿?1±4％。與cnp-22的交叉反應(yīng)性為100％，與nt-cnp-53、anp和bnp的交叉反應(yīng)性為0％。對于nt-cnp-53，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.5-128pg。試驗(yàn)間和試驗(yàn)內(nèi)差異分別為10％和6％?；厥章蕿?2±5.2％。與anp、bnp、cnp-22、cnp-53和內(nèi)皮素的交叉反應(yīng)性為0％。

尿液生物標(biāo)記排泄

可通過尿液總體積(ml)和尿液收集時(shí)間(小時(shí))確定平均尿流(ml/小時(shí))。以尿液生物標(biāo)記濃度(pg/ml或ng/ml)和尿流速率(ml/小時(shí))的結(jié)果計(jì)算尿液生物標(biāo)記排泄，并在對尿液肌酸酐排泄(ng/gcr)進(jìn)行調(diào)節(jié)后報(bào)道。

血漿生物標(biāo)記試驗(yàn)

將血液置于edta管中并冷凍，直至4℃、2500rpm離心10分鐘。將血漿分裝為1ml并凍存于-20℃直至測試。使用與尿液相同的非平衡ria(菲尼克斯制藥公司(phoenixpharmaceuticals)，加利福尼亞州貝爾蒙特)以及抗-人cnp抗體確定cnp分子形式的血漿濃度。使用電化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)測量血漿nt-probnp，如先前他處所述(costello-boerrigter等，j.am.collegecardiol.，47：345-53(2006))。nt-probnp檢測的下限為5pg/ml；試驗(yàn)間和試驗(yàn)內(nèi)差異分別為3.1％和2.5％。與cnp形式不存在交叉反應(yīng)性。

統(tǒng)計(jì)分析

所有尿液生物標(biāo)記均表現(xiàn)為非高斯分布；因此數(shù)值表示為中位數(shù)±四分位差。對于adhf和對照對象之間的比較，使用了非參數(shù)威爾科克森(wilcoxon)秩和檢驗(yàn)。使用斯皮爾曼(spearman′s)秩相關(guān)確定連續(xù)變量之間的關(guān)系。在cox回歸分析前使用自然對數(shù)轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)化生物標(biāo)記排泄數(shù)據(jù)以檢測以下獨(dú)立預(yù)測因子：(i)死亡率，以及(ii)到首次非選擇性所有原因再入院治療/死亡的時(shí)間。通過包括當(dāng)?shù)爻跫壸o(hù)理數(shù)據(jù)的機(jī)構(gòu)記錄確定死亡率和再入院治療。否則在末次已知隨訪時(shí)審查患者。使用c-統(tǒng)計(jì)以比較生物標(biāo)記的分辨力(harrell等，statisticsinmedicine，15：361-87(1996))。c-統(tǒng)計(jì)與二元端點(diǎn)(binaryendpoint)的曲線下面積相似，并可將其解釋為使用cox模型的風(fēng)險(xiǎn)評分正確排序的事件時(shí)間的可能性。使用計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差中的近似重疊法計(jì)算c-統(tǒng)計(jì)的置信區(qū)間。此外，利用綜合鑒別指數(shù)(idi)(pencina等，statisticsinmedicine，27：157-72(2008)；討論部分207-12)，使用cnp和血漿nt-probnp的組合代替單獨(dú)使用nt-probnp評價(jià)用于adhf中的不良后果(死亡率和重新入院/死亡)預(yù)測精確度方面的提升。概率值為雙側(cè)的；p＜0.05被認(rèn)為具有顯著性。使用jmp軟件版本9.0(sas研究院有限公司(sasinstitute，inc)，北卡羅來納州卡雷)和sas版本9.2(sas研究院有限公司(sasinstitute，inc)，北卡羅來納州卡雷)分析數(shù)據(jù)。

結(jié)果

表2顯示了研究群體的基線臨床和生化特性。確認(rèn)為adhf的患者的年齡大于對照組(70.1±10.3對比53.5±6.1歲，p＜0.0001)，23名(40％)為女性；且平均左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)為38.4±18.9％。22名(38％)adhf患者的主要癥狀為單獨(dú)的呼吸困難；4名(7％)患者為單獨(dú)的水腫；而24名(41％)患者為呼吸困難和外周性水腫。剩余的一些患者在心率失常相關(guān)的癥狀下出現(xiàn)為乏力或adhf。55％的患者存在nyhaiii類。相比于對照組，adhf患者中血漿nt-probnp顯著升高同時(shí)gfr下降(p＜0.0001)(表2)。觀察到adhf患者中的尿液肌酸酐濃度低于對照組(表3)，可能與臨床adhf管理期間的鼓舞或利尿療法的升級相關(guān)。

表2.基線特征。

*數(shù)值表示為平均值(sd)

μ值表示為中位數(shù)(第25-75百分位)。

cva，腦血管意外；crt，心臟再同步治療；lvef，左心室射血分?jǐn)?shù)；gfr，腎小球過濾速率；nt-probnp，腦利尿鈉肽前體n端；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段。

急性失代償性心力衰竭和尿液生物標(biāo)記排泄

所有尿液生物標(biāo)記的排泄速率均表現(xiàn)為非高斯分布。adhf中kim-1和所有三種cnp分子形式的排泄的中位數(shù)顯著高于對照組，尿總蛋白/肌酸酐比率也是如此(表3和圖12)。尿液ngal排泄沒有變化(p＝ns)。對adhf患者的尿液生物標(biāo)記排泄與臨床特性之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。kim-1表現(xiàn)出與gfr之間較弱且不明顯的關(guān)系(spearman’sρ-0.19；p＝0.098)，但任意尿液生物標(biāo)記和出現(xiàn)的nyha類(iii或iv)之間不存在明顯的關(guān)系，也沒有明顯的與lvef(無收縮劑)相關(guān)的趨勢(兩者中p＝ns)。

表4顯示了尿液cnp的排泄速率與其他測量的hf生物標(biāo)記之間的單變相關(guān)系數(shù)。三種尿液cnp分子形式之間均觀察到中度關(guān)聯(lián)，但只有尿液cnp-22與其在血漿中的濃度有關(guān)聯(lián)，盡管只是中度關(guān)聯(lián)(ρ0.28，p＝0.04)。尿液cnp-22和cnp-53與血漿nt-probnp弱相關(guān)(分別為p0.45，p＝0.0003；ρ0.33，p＝0.01)；尿液nt-cnp-53沒有相關(guān)性。尿液cnp-22(p0.68，p＝0.0001)和尿液kim-1(ρ0.78，p＜0.0001)與尿液總蛋白/肌酸酐比率顯著相關(guān)，而以下的其他尿液生物標(biāo)記并不明顯：cnp-53、nt-cnp-53或ngal。

在adhf患者中，入院時(shí)藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素受體阻斷劑(66％)、β阻斷劑(76％)、髓袢利尿藥(84％)和醛固酮拮抗劑(21％)。探索性分析中，在使用髓袢利尿藥的adhf患者中，在使用acei或arb的情況下尿液ngal高于(中位數(shù)±iqr：443±1924相對于177±227ng/gcr；p＝0.003)，且尿液nt-cnp-53低于(34.0±43.7相對于60.4±202.0；p＝0.01)那些不使用者。當(dāng)前組中未觀察到使用這些藥劑與尿液cnp-22、cnp-53、或kim-1水平之間的其他顯著關(guān)聯(lián)。

表3.尿液生物標(biāo)記排泄。

*數(shù)值表示為平均值(sd)

§值表示為中位數(shù)(第25-75百分位)。

kim-1，腎損傷分子1；ngal，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段。

表4.相關(guān)性分析：adhf患者中cnp分子形式和疾病嚴(yán)重性或預(yù)后的其他潛在重要生物標(biāo)記之間的斯皮爾曼ρ(rho)秩相關(guān)系數(shù)。

gfr，腎小球過濾效率；kim-1，腎損傷分子1；ngal，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；cnp-22，c型利尿鈉肽-22；cnp-53，c型利尿鈉肽-53；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；nt-probnp，腦利尿鈉肽前體n端。

c型利尿鈉肽的血漿濃度

表2顯示了cnp分子形式和nt-probnp的血漿濃度。相比于對照組，adhf組中血漿cnp-22和cnp-53水平升高，而血漿nt-cnp-53水平?jīng)]有改變。血漿cnp-22與其同時(shí)的尿液排泄限制性相關(guān)(ρ0.28，p＝0.04)，并與尿液cnp-53(ρ0.24，p＝0.07)和nt-cnp-53(ρ0.26，p＝0.05)排泄之間存在微弱的正相關(guān)關(guān)系(表4)。相反地，血漿cnp-53和血漿nt-cnp-53與任何cnp分子形式的尿液排泄之間均不存在任何關(guān)系。

臨床結(jié)果

58名被研究的adhf患者中，在后續(xù)隨訪的平均(sd)時(shí)間為1.5(0.9)年中有18人死亡(總adhf死亡率為31％)。另外有18名adhf患者再入院治療(所有原因再入院治療/死亡率為62％)，其中13名患者再入院治療時(shí)主要存在心血管病因。對兩名患者進(jìn)行選擇性心臟再同步治療；最終分析的事件中并不包括這些。

死亡的adhf患者的年齡大于對照組(74.8±9.2相對于67.9±10.2歲，p＝0.02)但兩組的性別、nyha類型和lvef類似。同樣，隨訪期間出現(xiàn)所有原因再入院治療/死亡的次要結(jié)果的adhf患者與沒有這些基線特征相關(guān)事件的adhf患者之間沒有差異。該組中有或沒有不良結(jié)果的adhf患者之間的血漿nt-probnp或gfr水平均沒有顯著性差異。所評估的尿液生物標(biāo)記中，相比與幸存者，死亡的adhf患者中所有三種cnp形式的水平均有升高(圖13a-c和14a-c)。尿液kim-1和ngal排泄沒有變化(兩者p＝ns)。死亡的adhf患者的血漿cnp-22水平高于幸存者(15.8±18.8相對于10.5±8.3pg/ml；p＝0.02)，但血漿cnp-53和nt-cnp-53沒有顯著差異。對于出現(xiàn)次要結(jié)果的患者，尿液cnp-22和nt-cnp-53排泄表現(xiàn)出升高的趨勢(cnp-22中位數(shù)：15.3相對于9.3ng/gcr，p＝0.07；nt-cnp-53：37.4相對于32.6ng/gcr，p＝0.06)，血漿cnp-22也是如此(13.8±16.3相對于10.5±7.7；p＝0.06)。其他尿液生物標(biāo)記和血漿cnp形式?jīng)]有變化。

cox回歸分析(表5)表明，在所有評估的尿液和血漿生物標(biāo)記中，只有尿液nt-cnp-53排泄能夠顯著地預(yù)測死亡率(單變量hr1.67，95％ci1.14-2.37，p＝0.01)和所有原因再入院治療/死亡(單變量hr1.78，95％ci1.30-2.39，p＝0.0004)。此外，在對年齡、尿液蛋白質(zhì)/肌酸酐比率和血漿nt-probnp調(diào)整后其關(guān)聯(lián)仍持續(xù)存在(表5)。在所有原因死亡率發(fā)生的c-統(tǒng)計(jì)(c-指數(shù))分析中，尿液nt-cnp-53的c-統(tǒng)計(jì)(0.66；95％ci0.53-0.78)與nt-probnp的(0.57，95％ci0.43-0.71)相當(dāng)，且生物標(biāo)記的組合(尿液nt-cnp-53和血漿nt-probnp)提供了遞增效應(yīng)的證據(jù)，組合c-統(tǒng)計(jì)為0.69(95％ci0.56-0.82)。綜合鑒別指數(shù)的檢測為尿液nt-cnp-53和血漿nt-probnp組合顯著提升該組中不良結(jié)果的預(yù)測提供了進(jìn)一步證據(jù)(表6)。本研究中其他尿液或血漿生物標(biāo)記均未表現(xiàn)出顯著的預(yù)測價(jià)值。

表5.adhf患者中尿液nt-cnp-53排泄和血漿nt-probnp對于臨床結(jié)果的預(yù)測價(jià)值。單變量和調(diào)整后cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析。

*ln轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)(風(fēng)險(xiǎn)比率以1個(gè)對數(shù)單位為單位增加)

模型1：根據(jù)年齡調(diào)整

模型2：根據(jù)年齡和尿液蛋白質(zhì)/肌酸酐比率調(diào)整

模型3：根據(jù)年齡、尿液蛋白質(zhì)/肌酸酐比率和血漿nt-probnp調(diào)整cv，心血管；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；nt-probnp，b型利尿鈉肽前體n端；ns，無顯著性(即p＞0.05)。

表6.預(yù)測精確度的測量

血漿nt-probnp

尿液nt-cnp-53

*相比于單獨(dú)的nt-probnp

nt-probnp，b型利尿鈉肽前體n端；nt-cnp-53，c型利尿鈉肽-53n端片段；se，標(biāo)準(zhǔn)誤差。

這些結(jié)果證明升高的kim-1排泄水平似乎能夠區(qū)分失代償性心力衰竭患者和健康的對照患者，但與心力衰竭結(jié)果不相關(guān)。相反地，升高的尿液nt-cnp-53排泄水平與異質(zhì)性入院治療心力衰竭群體(如adhf患者)中的不良結(jié)果之間顯著相關(guān)，獨(dú)立于gfr。nt-cnp-53是唯一有預(yù)測價(jià)值的尿液生物標(biāo)記。

實(shí)施例3-血漿cnp-22是一種能夠預(yù)測普通人群中死亡和心肌梗塞的內(nèi)皮細(xì)胞生物標(biāo)記

以下實(shí)施例用于確定血漿cnp-22是否是一種來源于內(nèi)皮細(xì)胞的、能夠預(yù)測普通人群中未來死亡率和心肌梗塞(mi)的生物標(biāo)記。評估了1，841名對象(平均年齡62±11歲，48％為男性)的血漿cnp-22，這些對象隨機(jī)選自美國明尼蘇達(dá)州奧姆斯特德縣(olmstedcounty)的普通社區(qū)。對死亡率和mi的隨訪時(shí)間中位數(shù)為12年。在12年的隨訪期間內(nèi)，升高的血漿cnp-22水平(cnp-22＞16pg/ml)與死亡率(未調(diào)整hr1.41，95％ci1.12-1.79；p＝0.004)和mi(未調(diào)整hr1.60，95％ci1.19-2.16；p＝0.002)顯著相關(guān)(表7)。在根據(jù)傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素(如年齡、性別、體重指數(shù)(bmi)、膽固醇、血清肌酸酐、吸煙、以及糖尿病和高血壓的發(fā)生)進(jìn)行調(diào)整后，升高的血漿cnp-22水平仍與死亡率(調(diào)整后hr1.34，95％ci1.02-1.75；p＝0.04)和mi(調(diào)整后hr1.59，95％ci1.13-2.25；p＝0.008)顯著相關(guān)(表7)。

表7.升高的血漿cnp-22水平預(yù)測死亡率和心血管疾病(所有組；n＝1841)。

模型3：年齡、性別、bmi、總膽固醇、血清肌酸酐、吸煙，發(fā)生糖尿病、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病

圖15a和15b分別顯示了根據(jù)血漿cnp-22四分位數(shù)的死亡和mi。未調(diào)整的死亡和mi事件發(fā)生率隨著分別顯示了根據(jù)血漿cnp-22四分位數(shù)的升高顯著提高，其中cnp-22q1＝2.0至10.1pg/ml；cnp-22q2＝10.2至13.1pg/ml；cnp-22q3＝13.2至16.7pg/ml；且cnp-22q4＝16.8至265.0pg/ml。

這些結(jié)果證明升高的血漿cnp-22水平是一種能夠預(yù)測普通人群中未來心臟相關(guān)死亡和mi的內(nèi)皮細(xì)胞生物標(biāo)記。這些結(jié)果還證明可對血漿cnp-22水平升高者使用早期mi檢測策略和/或用于mi預(yù)防的積極治療策略。

其他實(shí)施方式

應(yīng)理解雖然本發(fā)明已結(jié)合其詳述進(jìn)行描述，但以上描述意在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其他方面、優(yōu)勢和修改在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

序列表

<110>梅約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會(huì)（mayofoundationformedicaleducationandresearch）

<120>評估腎結(jié)構(gòu)改變和結(jié)果

<130>07039-1097wo1

<140>pct/us2012/059670

<141>2012-10-11

<150>61/580,139

<151>2011-12-23

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

lysproglyalaproprolysvalproarg

1510

<210>2

<211>12

<212>prt

<213>智人

<400>2

aspargserargleuleuargaspleuargvalasp

1510

<210>3

<211>29

<212>prt

<213>智人

<400>3

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