本發(fā)明屬于腫瘤生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,涉及用于鼻咽癌的生物標(biāo)志物、檢測試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù):
:鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,npc)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜,具有較高惡性程度和極強轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤。鼻咽癌是多基因遺傳性疾病,其發(fā)病與遺傳因素(遺傳易感性)、eb病毒感染、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān),早期診斷、早期治療是挽救患者生命和提高生活質(zhì)量的最有效手段。遺憾的是,鼻咽癌起病隱匿,具有強烈的轉(zhuǎn)移傾向。據(jù)統(tǒng)計,約75%的患者在就診時就已到達晚期,發(fā)生局部淋巴結(jié)和/或遠處轉(zhuǎn)移,治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則預(yù)后極差,成為鼻咽癌治療失敗的主要原因。因此,篩查鼻咽癌的腫瘤標(biāo)記物,爭取早期發(fā)現(xiàn)、選擇最佳治療方案、預(yù)測預(yù)后、監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移對鼻咽癌診療具有重要的臨床意義。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供鼻咽癌的生物標(biāo)志物組合、檢測試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:特異性識別細胞因子sell,ccl24,mmp3,msp-alpha,hcc-4中至少一種的試劑在制備鼻咽癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。能對細胞因子sell,ccl24,mmp3,msp-alpha、hcc-4中至少一種進行定量的試劑在制備鼻咽癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。特異性識別細胞因子timp-2,igf-i,il-8,sell,ccl24,mmp3,msp-alpha和hcc-4的試劑在制備鼻咽癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。能對細胞因子timp-2,igf-i,il-8,sell,ccl24,mmp3,msp-alpha和hcc-4進行定量的試劑在制備鼻咽癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種鼻咽癌的輔助診斷試劑盒,該試劑盒含有特異性識別細胞因子sell,ccl24,mmp3,msp-alpha,hcc-4中至少一種的試劑。一種鼻咽癌的輔助診斷試劑盒,該試劑盒含有能對細胞因子sell,ccl24,mmp3,msp-alpha、hcc-4中至少一種進行定量的試劑。一種鼻咽癌的輔助診斷試劑盒,該試劑盒含有特異性識別細胞因子timp-2,igf-i,il-8,sell,ccl24,mmp3,msp-alpha和hcc-4的試劑。一種鼻咽癌的輔助診斷試劑盒,該試劑盒含有能對細胞因子timp-2,igf-i,il-8,sell,ccl24,mmp3,msp-alpha和hcc-4進行定量的試劑。進一步的,上述試劑盒的檢測原理為elisa原理。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明發(fā)現(xiàn)血清標(biāo)志物細胞因子timp-2,igf-i,il-8,sell,ccl24,mmp3,msp-alpha和hcc-4和鼻咽癌密切相關(guān),可用于臨床診斷及預(yù)防檢測,具有很好的實際應(yīng)用價值。且直接針對血清中的標(biāo)志物進行檢查,使得操作方便、快速,適于推廣應(yīng)用。附圖說明圖1為細胞因子芯片檢測后的熒光掃描檢測圖;圖2為蛋白芯片數(shù)據(jù)的箱線圖;箱線圖中的橫線是整個組的數(shù)據(jù)的中位數(shù)。圖3為差異表達細胞因子的非層次聚類分析圖;綠色平均值代表低豐度蛋白,黑色代表中位數(shù)水平,紅色代表高豐度蛋白。圖4為elisa法檢測細胞因子的表達量。具體實施方式在本發(fā)明中,提供了一種測量針對一組特異性腫瘤生物標(biāo)志物以對癌癥進行篩查檢測和定量方法。與正常人比較,鼻咽癌患者血清中可能含存在一些具有表達差異的細胞因子。對該組獨特的蛋白(生物標(biāo)志物)的評價將對常規(guī)診斷方法進行補充并有利于癌癥的早期診斷。本發(fā)明收集12例,沒有接受過化療和放療的,經(jīng)過免疫組化和病理診斷確診為鼻咽癌患者的血液樣本,同時收集12例健康人的血液樣本作為對照。通過使用基于蛋白芯片的方法,在本發(fā)明中從患者的血清中鑒定了一組鼻咽癌癌生物標(biāo)志物,相對于正常對照樣本,包括timp-2,sell,ccl24,mmp3,igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上調(diào),而msp-alpha和hcc-4下調(diào)。用elisa方法驗證了此組鼻咽癌生物標(biāo)志物的特異性和準(zhǔn)確性,并一起用于篩查鼻咽癌。測試后的數(shù)據(jù)用spss統(tǒng)計軟件進行分析,組間差異用student’sttest來分析,p<0.05被認為是有統(tǒng)計學(xué)意義。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明,但并不局限于此。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容,特舉以下實施例結(jié)合附圖詳細說明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑,均為市售產(chǎn)品。實施例11)樣本準(zhǔn)備從南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山第一人民醫(yī)院病理系收集12例,沒有接受過化療和放療的,經(jīng)過免疫組化和病理診斷確診為鼻咽癌患者的血液樣本,同時收集12例健康人的血液樣本作為對照,樣品信息見表要。將血液樣本離心取上層血清。表1臨床樣本信息患者數(shù)量12人年齡(mean±sd),歲49.4±8.9性別男性=50%,女性=50%疾病分期ii=75%,iii=25%治療否健康對照數(shù)量12人年齡(mean±sd),歲44.1±5.1性別男性=50%,女性=50%p-value(年齡,患者vs健康對照)0.0852)芯片篩選血清標(biāo)志物實驗方法:本實施例采用raybio公司人細胞因子芯片humancytokineantibodyarray(raybiohumancytokineantibodyarraygseries2000,catno:aah-cyt-g2000,raybiotechco,norcrossga,usa)檢測血清中174種細胞因子。將上步收集的血清稀釋二倍之后,加入細胞因子芯片中孵育二個小時。洗滌之后,加入biotin偶聯(lián)的抗體復(fù)合物室溫孵育2小時。洗滌之后,加入cy3-conjugatedstreptavidin到蛋白芯片上孵育2小時。最后,用genepix4000b掃描儀(axoninstruments,genepixversion5.0)掃描芯片,信號用genepix4000b軟件獲取,然后用raybiotech公司分析工具分析(raybiotechanalysistool,excel特定軟件)。實驗結(jié)果:1)芯片掃描對上述24份血清樣本(12健康者,12例鼻咽癌患者)進行芯片掃描,掃描結(jié)果如圖1所示,蛋白豐度與熒光強度成正比,芯片中每個樣品重復(fù)檢測2次。從熒光圖片上可以看到方框內(nèi)的熒光信號在對照組(control)和鼻咽癌患者組(npc)中存在明顯的熒光差異,提示說明這些細胞因子在鼻咽癌患者體內(nèi)的表達量可能存在顯著的差異,其中,timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上調(diào),而msp-alpha和hcc-4下調(diào)。進一步對相應(yīng)的熒光信號進行定量,定量結(jié)果如表2所示,表2為12例健康者的血清中8種細胞因子在芯片上的熒光信號值,為12例鼻咽癌患者的血清中8種細胞因子在芯片上的熒光信號值。3)芯片掃描數(shù)據(jù)分析及標(biāo)志物的確定1.芯片掃描數(shù)據(jù)的t-test分析利用芯片分析軟件中的t-test方法對上述芯片熒光值進行分析,其中有8種細胞因子的熒光信號強度(代表細胞因子含量)在正常人群和鼻咽癌患者中存在顯著性差異(p<0.05),具體分析結(jié)果如表2。分析結(jié)果顯示有5種細胞因子鼻咽癌患者的血清中上調(diào)表達,有3種細胞因子下調(diào)表達。表2蛋白芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果(鼻咽癌患者vs健康對照)2.箱線圖分析對上述蛋白芯片的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行t檢驗分析之后,二組之間部分有顯著性差異(p<0.05)的血清標(biāo)志物用箱線圖(boxplot)表述;箱線圖中的橫線是整個組的數(shù)據(jù)的中位數(shù)。箱線圖如圖2所示。采用spss統(tǒng)計軟件進行分析,統(tǒng)計方法均數(shù)間比較采用t檢驗,組間差異用student’sttest來分析,p<0.05被認為是有統(tǒng)計學(xué)意義和p<0.01(差異非常顯著)定為有統(tǒng)計學(xué)意義。從表2和圖2的分析中可以看出,分析腫瘤患者血清和正常人血清中174個因子的表達水平,結(jié)果顯示包括timp2,sell,ccl24,mmp3,igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上調(diào),而msp-alpha和hcc-4下調(diào)。3.非層次聚類分析用cluster3.0software軟件采用非層次聚類分析(unsupervised-hierarchicalclusteranalysis)分析具有顯著表達差異的8個血清標(biāo)志物(timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i、il-8、msp-alpha和hcc-4),分析結(jié)果如圖3所示,從中可以看出這8個血清標(biāo)志物完全能夠?qū)pc組和對照組顯著區(qū)分開。說明利用上述8種細胞因子作為診斷鼻咽癌的指標(biāo),效果良好。用cluster3.0software軟件采用非層次聚類分析(unsupervised-hierarchicalclusteranalysis)分析8個差異顯著的血清標(biāo)志物,結(jié)果顯示npc組和對照組能顯著區(qū)分.(3)elisa驗證血清標(biāo)志物收集另外20例正常樣本和20例鼻咽癌患者(npc)血清樣本,用購買的商品化的試劑盒(raybiotech,norcrossga,usa),根據(jù)廠家使用說明操作,進一步檢測上述存在表達差異的細胞因子,其中包括timp-2,sell,ccl24,mmp3,igf-i,il-8,msp-alpha和hcc-4。將稀釋后血清樣本分別加入相應(yīng)的elisa板中,室溫孵育2.5小時。洗滌elisa板子三次之后,加入生物素偶聯(lián)的抗體(biotin-conjugatedantibody)孵育2小時。洗滌elisa板子三次之后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(hrp-conjugatedstreptavidin)孵育30分鐘,洗滌三次之后加入tmb底物顯色。最后,加入硫酸(sulfuricacid)中止反應(yīng),用酶標(biāo)儀microplatereader(biorek,usa,elx800nb)分析光密度。采用spss統(tǒng)計軟件進行分析,統(tǒng)計方法均數(shù)間比較采用t檢驗,組間差異用student’sttest來分析,p<0.05被認為是有統(tǒng)計學(xué)意義和p<0.01(差異非常顯著)定為有統(tǒng)計學(xué)意義。分析鼻咽癌患者血清和正常人血清中174個細胞因子的表達水平。檢測結(jié)果如圖4所示,從中可以看出,timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上調(diào),而msp-alpha和hcc-4下調(diào),與細胞因子芯片檢測結(jié)果一用t檢驗分析驗證后的elisa數(shù)據(jù),elisa結(jié)果和蛋白芯片結(jié)果一致。npc組和對照組(p<0.05,mann-whitneyutestanalysis)。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12