本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬瘟熱、犬細(xì)小抗體的elisa檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式的轉(zhuǎn)變，養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)，其規(guī)模在不斷擴(kuò)大；隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，寵物犬的飼養(yǎng)量在也逐年增加，而對(duì)這些行業(yè)發(fā)展造成最大影響的就是犬類傳染病的爆發(fā)，對(duì)于這些傳染病的預(yù)防與控制形式也愈加嚴(yán)峻。在犬類疫病中，犬瘟熱和犬細(xì)小是發(fā)病率及死亡率都較高的疫病。犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性傳染病，傳染性極強(qiáng)，死亡率可達(dá)80％以上。犬瘟熱初期狗的體溫高達(dá)39.5-41攝氏度，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水樣分泌物，打噴嚏，有腹瀉癥狀。在以后2-14天內(nèi)再次出現(xiàn)胃腸道疾病，嘔吐、拉稀，有膿性筆體、膿性眼屎，精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟熱發(fā)病后期會(huì)出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，口吐白沫，抽搐，但以冬、春多發(fā)，犬是主要的自然宿主。而犬類感染細(xì)小病毒后發(fā)病急，死亡率高，常呈爆發(fā)性流行；不同年齡、性別、品種的犬均可感染，但八月齡以內(nèi)的幼犬最易感染且死亡率高達(dá)70％。病犬和康復(fù)帶毒犬經(jīng)糞便、尿液、唾液和嘔吐物向外界排毒后污染飼料、飲水、食具及周邊環(huán)境。健康犬直接接觸病犬或者進(jìn)入被污染環(huán)境通過消化道感染。
我國(guó)的犬類疫病防控缺乏有效的綜合防控體系，既不利于犬類疫病防控，也不利于人類的身體健康。犬類經(jīng)過接種疫苗后往往存在一種情況，即不知道免疫效果如何，導(dǎo)致了有些犬接種疫苗以后仍然發(fā)病，而市面上流行的試劑盒往往只能檢測(cè)犬瘟熱或犬細(xì)小，這兩種常見病通常需要購(gòu)買2個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)形中增大了工作量，工作繁瑣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方便、高效、通過檢測(cè)血清抗體來(lái)判斷接種疫苗后的犬類免疫保護(hù)狀況的犬瘟熱、犬細(xì)小抗體的elisa檢測(cè)試劑盒。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種犬瘟熱、犬細(xì)小抗原的elisa檢測(cè)試劑盒，包括elisa板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、酶標(biāo)單克隆抗體、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；
上述elisa板條：每個(gè)試劑盒裝有1塊elisa微孔板，每塊elisa板條為能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原為原核表達(dá)的h蛋白及vp2基因，規(guī)格為6孔×10條；
上述血清稀釋液為即用型；
上述濃縮洗滌液為20倍濃縮；
上述底物顯色液為即用型tmb顯色液，10ml；
上述終止液為2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶標(biāo)單克隆抗體為：辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬igg多克隆抗體，使用前100倍稀釋；
上述陽(yáng)性對(duì)照為：經(jīng)高溫滅活的經(jīng)疫苗免疫后的犬血清稀釋液；
上述陰性對(duì)照為：經(jīng)高溫滅活的未患病，且未經(jīng)疫苗免疫的犬血清稀釋液。
本發(fā)明還公開了上述的檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小抗原的elisa檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗原中的應(yīng)用。
本發(fā)明一種犬瘟熱、犬細(xì)小抗體的elisa檢測(cè)試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：兩種檢測(cè)方法整合至一個(gè)試劑盒，給使用者提供了方便且降低了使用成本。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明中犬瘟熱、犬細(xì)小抗原的elisa檢測(cè)試劑盒；
其中：1.犬瘟熱病毒h蛋白；2.犬細(xì)小病毒vp2基因。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明一種犬瘟熱、犬細(xì)小抗原的elisa檢測(cè)試劑盒，包括elisa板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、酶標(biāo)單克隆抗體、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；
上述elisa板條：每個(gè)試劑盒裝有1塊elisa微孔板，每塊elisa板條為能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原為原核表達(dá)的h蛋白及vp2基因，規(guī)格為6孔×10條；
上述血清稀釋液為即用型；
上述濃縮洗滌液為20倍濃縮；
上述底物顯色液為即用型tmb顯色液，10ml；
上述終止液為2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶標(biāo)單克隆抗體為：辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬igg多克隆抗體，使用前100倍稀釋；
上述陽(yáng)性對(duì)照為：經(jīng)高溫滅活的經(jīng)疫苗免疫后的犬血清稀釋液；
上述陰性對(duì)照為：經(jīng)高溫滅活的未患病，且未經(jīng)疫苗免疫的犬血清稀釋液。
本發(fā)明還公開了上述的檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小抗原的elisa檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗原中的應(yīng)用。
一、抗原制備
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的表達(dá)：
根據(jù)genbank中犬瘟熱病毒h基因序列及犬細(xì)小病毒vp2基因序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，采用pcr方法從dna中擴(kuò)增出h基因片段及vp2基因片段，將其克隆到表達(dá)載體pet28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pet-h及pet-vp2基因，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌bl21(de3)，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的純化：
誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體為：超聲1.5s，間隔2s，共10min。然后10000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行sds-page分析。蛋白純化時(shí)使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測(cè)定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.05，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1500μg/ml；犬細(xì)小病毒vp2純化后od值為1.85，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1200μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經(jīng)檢驗(yàn)合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無(wú)其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預(yù)處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0的醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了?，?0分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時(shí)，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清液經(jīng)尼龍篩過濾，尼龍篩孔徑為125um，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh溶液調(diào)ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時(shí)；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量pbs中，對(duì)50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出后，12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記：
以上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標(biāo)記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對(duì)1mmph為4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；向其中再加入20μl、0.2m、ph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時(shí)；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4溶液，混勻，4℃放置2小時(shí)；所得產(chǎn)物在0.1m、ph為7.4的pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時(shí)。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將溶液裝入透析袋中，對(duì)0.1mph為7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細(xì)小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細(xì)小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標(biāo)板封閉，加入待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體與酶標(biāo)板中包被的h、vp2基因發(fā)生抗原反應(yīng)，加入酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標(biāo)抗體與上一步反應(yīng)結(jié)束的h、vp2基因抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測(cè)樣本中犬細(xì)小igg抗體的含量成正比。
2.本發(fā)明試劑盒的組成：
a)酶標(biāo)板的最佳制備方法：
用ph9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時(shí)，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
ph為7.4，濃度為0.15m的pbs洗滌液中各組分及含量如下：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲(chǔ)液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌液至100ml；
底物緩沖液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml，ph為5.0；
四甲基聯(lián)苯胺tmb顯色液：tmb(10mg/5ml無(wú)水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul：
終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質(zhì)量濃度為98％的濃硫酸21.7ml。
c)檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的elisa試劑盒的組建：
組建檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標(biāo)板；
辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽(yáng)性對(duì)照；
陰性對(duì)照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb底物；
終止液；
產(chǎn)品說(shuō)明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的檢測(cè)：
1.用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)：
1)將待測(cè)血清、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。
2.檢測(cè)結(jié)果分析：
1)檢測(cè)中陽(yáng)性對(duì)照血清(pc)的od值與陰性對(duì)照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時(shí)，檢測(cè)被認(rèn)為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對(duì)照血清od值；
pc＝陽(yáng)性對(duì)照血清od值；
2)檢測(cè)時(shí)使用復(fù)孔，最終使用od值為兩個(gè)的平均值。
當(dāng)血清樣本的od值低于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陰性。
當(dāng)血清樣本的od值高于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陽(yáng)性。
實(shí)例2：
一、抗原制備：
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的表達(dá)：
根據(jù)genbank中瘟熱病毒h基因序列及犬細(xì)小病毒vp2基因序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，采用pcr方法從dna中擴(kuò)增出h基因片段以及vp2基因片段，將其克隆到表達(dá)載體pet28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pet-h及pet-vp2基因，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌bl21(de3)，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的純化：
誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體過程為：超聲1.0s，間隔1s，共10min；然后10000rpm離心，分別收集上清液和沉淀，進(jìn)行sds-page分析。蛋白純化時(shí)使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測(cè)定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.25，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1600μg/ml；犬細(xì)小病毒vp2純化后od值為1.75，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1100μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經(jīng)檢驗(yàn)合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無(wú)其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預(yù)處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0的醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了?，?0分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時(shí)，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125um)，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh調(diào)ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時(shí)；12000r/min離心30分鐘，棄上清液；沉淀溶于適量pbs中，對(duì)50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記：
上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標(biāo)記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對(duì)1mmph4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4℃過夜；向其中再加入20μl0.2mph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時(shí)；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混勻，4℃放置2小時(shí)；所得產(chǎn)物對(duì)0.1mph為7.4pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時(shí)。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.1mph7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發(fā)明重試劑盒的檢測(cè)原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細(xì)小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細(xì)小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標(biāo)板封閉，加入待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體與酶標(biāo)板中包被的h、vp2基因發(fā)生抗原反應(yīng)，加入酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標(biāo)抗體與上一步反應(yīng)結(jié)束的h蛋白及vp2基因抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測(cè)樣本中犬細(xì)小igg抗體的含量成正比。
2.本發(fā)明試劑盒的組成：
a)酶標(biāo)板的最佳制備方法
用ph為9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h蛋白、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h蛋白、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時(shí)，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
濃度0.15m，ph為7.4的pbs洗滌液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲(chǔ)液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌緩沖液至100ml；
底物緩沖液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml；
四甲基聯(lián)苯胺tmb底物顯色液：tmb(10mg/5ml無(wú)水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質(zhì)量濃度為98％的濃硫酸21.7ml；
c)檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的間接elisa試劑盒的組建：
組建檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標(biāo)板；
辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽(yáng)性對(duì)照；
陰性對(duì)照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb顯色液；
終止液；
產(chǎn)品說(shuō)明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的檢測(cè)：
1.用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)：
1)將待測(cè)血清、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。
2.檢測(cè)結(jié)果分析
1)檢測(cè)中陽(yáng)性對(duì)照血清(pc)的od值與陰性對(duì)照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時(shí)，檢測(cè)被認(rèn)為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對(duì)照血清od值；
pc＝陽(yáng)性對(duì)照血清od值；
2)檢測(cè)時(shí)使用復(fù)孔，最終使用od值為兩個(gè)的平均值。
當(dāng)血清樣本的od值低于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陰性。
當(dāng)血清樣本的od值高于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陽(yáng)性。
實(shí)例3：
一、抗原制備：
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的表達(dá)：
根據(jù)genbank中瘟熱病毒h基因序列及犬細(xì)小病毒vp2基因序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，采用pcr方法從dna中擴(kuò)增出h基因片段以及vp2基因片段，將其克隆到表達(dá)載體pet28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pet-h及pet-vp2基因，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌bl21(de3)，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細(xì)小病毒vp2基因的純化：
誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體過程如下：超聲1.0s，間隔2s，共15min；然后12000rpm離心，分別收集上清液和沉淀，進(jìn)行sds-page分析。蛋白純化時(shí)使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測(cè)定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.15，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1500μg/ml；犬細(xì)小病毒vp2純化后od值為1.55，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為900μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經(jīng)檢驗(yàn)合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無(wú)其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預(yù)處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了?，?0分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時(shí)，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清液經(jīng)尼龍篩過濾，篩網(wǎng)孔徑為125um，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時(shí)；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量pbs中，對(duì)50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記：
上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標(biāo)記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對(duì)1mmph為4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4℃過夜；向其中再加入20μl0.2mph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時(shí)；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混勻，4℃放置2小時(shí)；所得產(chǎn)物對(duì)0.1mph為7.4pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時(shí)。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.1mph7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細(xì)小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細(xì)小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標(biāo)板封閉，加入待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體與酶標(biāo)板中包被的h蛋白、vp2基因發(fā)生抗原反應(yīng)，加入酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標(biāo)抗體與上一步反應(yīng)結(jié)束的h蛋白、vp2基因抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測(cè)樣本中犬細(xì)小igg抗體的含量成正比。
2.本發(fā)明試劑盒的組成：
a)酶標(biāo)板的最佳制備方法：
用ph為9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h蛋白、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時(shí)，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
濃度為0.15m，ph為的7.4pbs洗滌液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲(chǔ)液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌緩沖液至100ml；
底物緩沖液(ph5.0磷酸檸檬酸)：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml；
四甲基聯(lián)苯胺tmb底物顯色液：tmb(10mg/5ml無(wú)水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質(zhì)量濃度為98％的濃硫酸21.7ml；
c)檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的間接elisa試劑盒的組建：
組建檢測(cè)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標(biāo)板；
辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽(yáng)性對(duì)照；
陰性對(duì)照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb底物；
終止液；
產(chǎn)品說(shuō)明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細(xì)小igg抗體的檢測(cè)：
1.用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)：
1)將待測(cè)血清、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標(biāo)兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。
2.檢測(cè)結(jié)果分析：
1)檢測(cè)中陽(yáng)性對(duì)照血清(pc)的od值與陰性對(duì)照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時(shí)，檢測(cè)被認(rèn)為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對(duì)照血清od值；
pc＝陽(yáng)性對(duì)照血清od值；
2)檢測(cè)時(shí)使用復(fù)孔，最終使用od值為兩個(gè)的平均值。
當(dāng)血清樣本的od值低于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陰性。
當(dāng)血清樣本的od值高于cutohh值時(shí)，該樣本為犬細(xì)小病毒igg抗體陽(yáng)性。