本發(fā)明涉及一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片，該紙微流控芯片檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)小分子H₂O₂，能夠廣泛應(yīng)用于疾病的早期診治、藥物篩選等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

21世紀(jì)是科學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)的時(shí)代，傳統(tǒng)的分析技術(shù)也在經(jīng)歷著深刻的改革。其中，分析設(shè)備正走向微型化、集成化以及便攜化。微流控芯片實(shí)驗(yàn)室，又稱μTAS（微型全分析系統(tǒng)），是一種以在微米尺度的空間中對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的技術(shù),具有將生物和化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本功能微縮到一個(gè)幾平方厘米大小的芯片上的能力.微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在微小可控平臺(tái)上的靈活組合和規(guī)模集成。微型全分析系統(tǒng)是在上世紀(jì)九十年代由Manz等首次提出。經(jīng)過(guò)幾十年科研工作者的不斷探索，微流控芯片已經(jīng)成為一個(gè)獨(dú)立的科學(xué)領(lǐng)域，并在實(shí)際生活中得以應(yīng)用，逐漸在分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的作用。

紙微流控芯片或微流控紙分析簡(jiǎn)稱紙芯片，是微流控技術(shù)發(fā)展的最新領(lǐng)域，在2007年，被Whitesides研究組首次提出。紙芯片是以紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在紙的表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道的微型分析器件，常用的加工方法有石蠟打印法、噴墨打印法、絲網(wǎng)印刷法、光刻法等，一般用蠟、AKD、SU-8 光膠等作為紙芯片疏水隔離帶的疏水材料。紙芯片結(jié)合了微流控技術(shù)和紙的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的微流控芯片相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）試樣消耗量低，成本低；（2）來(lái)源豐富，容易得到，可進(jìn)行批量生產(chǎn)；（3）不需要外接泵，紙的主要成分是纖維素，流體在紙上通過(guò)毛細(xì)作用流動(dòng)；（4） 可在紙上根據(jù)自己的意愿設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)；（5）生物兼容性好，可通過(guò)化學(xué)修飾改變紙的性質(zhì)；（6）具有生物降解性；（7）一次性便攜式分析，操作簡(jiǎn)便，甚至不需要復(fù)雜的程序?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，紙芯片在微流控技術(shù)上受到廣大國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。

過(guò)氧化氫（H₂O₂）是細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的副產(chǎn)物，也是最穩(wěn)定的活性氧（ROS），在生命體內(nèi)影響著細(xì)胞的生命活動(dòng)，當(dāng)H₂O₂的含量較高，會(huì)導(dǎo)致各種生理疾病，引起各種炎癥，器官損壞乃至癌癥，因此對(duì)細(xì)胞H₂O₂含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)臨床診斷有著重要的意義。近年來(lái)，納米技術(shù)已廣泛用于化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)、材料、電子等學(xué)科領(lǐng)域，由于納米材料的尺寸、形狀以及表面電荷等性能與天然酶有一定的相似性。因而，利用納米材料獨(dú)特性能，合成在化學(xué)結(jié)構(gòu)、催化效率、特異性和選擇性上都和天然酶功能相似的納米人工模擬酶，可以有效克服天然酶的局限性，應(yīng)用于催化顯色底物與過(guò)氧化氫（H₂O₂）的顯色反應(yīng)。模擬酶的合成方法很多， 利用水熱合成法合成的新型過(guò)氧化物模擬酶、高效、綠色環(huán)保，對(duì)檢測(cè)小分子H₂O₂的含量，用于疾病的診斷分析有重要的意義。因此，選擇納米無(wú)機(jī)氧化鉬模擬酶（MoO₃）作為材料。對(duì)于H₂O₂ 的檢測(cè)方法有很多如比色法、熒光法、電化學(xué)法、光譜法。比色法檢測(cè)H₂O₂，不僅成本低、操作簡(jiǎn)單而且能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)H₂O₂水平。

本發(fā)明基于紙芯片易加工、低成本、微型化、便攜化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將紙微流控芯技術(shù)與納米生物技術(shù)結(jié)合建立快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確的細(xì)胞內(nèi)小分子H₂O₂的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的微流控芯片。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的微流控芯片，其特征在于，該微流控芯片以濾紙為基底，通過(guò)氧化鉬量子點(diǎn)模擬酶比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H₂O₂。

所述的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的微流控芯片，其特征在于，所采用的氧化鉬量子點(diǎn)模擬酶MoO₃，是用水熱合成法合成的。

所述的一種基于紙芯片的氧化鉬量子點(diǎn)模擬酶比色法，其特征在于，顯色體系為MoO₃、ABTS和H₂O₂。

所述的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的微流控芯片，其特征在于，H₂O₂濃度在1 μmol/L~10mmol/L 范圍內(nèi)，顯色體系的顯色強(qiáng)度ΔG與logH₂O₂ 濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其中r=0.9909，線性方程為ΔG=14.6954logC_H2O2 + 74.1004，檢測(cè)限為0.52 μmol/L。

本發(fā)明所述的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的微流控芯片的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)H₂O₂的方法，包括如下步驟:

(1)MoO₃量子點(diǎn)的合成;（2）紙微流控芯片的 H₂O₂測(cè)定：將MoO₃ -ABTS-H₂O₂ 顯色體系集成在紙微流控芯片上反應(yīng)，用拍照采集顏色變化圖像，ImageJ軟件對(duì)顏色變化的灰度值數(shù)據(jù)處理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)小分子H₂O₂。

具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的紙微流控芯片，以濾紙為基底，通過(guò)在紙上利用氧化鉬量子點(diǎn)模擬酶比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H₂O₂。

本發(fā)明所述的模擬酶MoO₃，是用水熱合成法合成的新型的量子點(diǎn)。

本發(fā)明所述的檢測(cè)原理為將MoO₃-ABTS-H₂O₂ 顯色體系集成在紙微流控芯片上反應(yīng)，通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)H₂O₂。

本發(fā)明的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片測(cè)定細(xì)胞內(nèi)H₂O₂的方法，依序包括如下步驟 ：

(1)MoO₃量子點(diǎn)的合成

將MoS₂通過(guò)超聲，抽濾和水熱反應(yīng)后得到的濾液，即得氧化鉬量子點(diǎn)（MoO₃）溶液。

（2）紙微流控芯片的 H₂O₂測(cè)定

將MoO₃-ABTS-H₂O₂ 顯色體系集成在紙微流控芯片上反應(yīng)，用拍照采集顏色變化圖像，ImageJ軟件對(duì)顏色變化的灰度值數(shù)據(jù)處理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)釋放小分子H₂O₂。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):

紙微流控芯片具有易加工、低成本、微型化、便攜化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

新型過(guò)氧化物模擬酶納米氧化鉬（MoO₃）穩(wěn)定、高效、綠色環(huán)保。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片工作原理圖。

圖2為本發(fā)明一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片的MoO₃ 材料TEM圖。

圖3為本發(fā)明一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片的線性關(guān)系圖。

圖4為本發(fā)明一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

如圖1所示， 本發(fā)明所述的一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片原理：基于紙芯片（優(yōu)選濾紙）易加工、低成本、微型化、便攜化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和新型過(guò)氧化物模擬酶納米氧化鉬（MoO₃）穩(wěn)定、高效、綠色環(huán)保的特性，本發(fā)明將紙基微流控芯技術(shù)與納米生物技術(shù)結(jié)合，把MoO₃-ABTS-H₂O₂ 顯色體系集成在紙微流控芯片上反應(yīng)，用拍照采集顏色變化圖像，ImageJ軟件對(duì)顏色變化的灰度值數(shù)據(jù)處理，檢測(cè)小分子H₂O₂。ABTS指2 ,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽。

實(shí)施例1：

納米氧化鉬量子點(diǎn)模擬酶制備步驟如下 ：稱取MoS₂納米片0.06g，加入到去離子水400 mL中，在65℃下持續(xù)超聲17小時(shí)后，用0.22 μm的微孔濾膜抽濾，收集濾餅；然后再分散到60 mL去離子水中，轉(zhuǎn)入到反應(yīng)釜中，在200 ℃水熱反應(yīng)12小時(shí)后，自然冷卻后，真空抽濾，收集反應(yīng)濾液，即得氧化鉬量子點(diǎn)（MoO₃）溶液。

如圖2中的A所示，該產(chǎn)物在水溶液中分散良好，沒(méi)有出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，粒子形狀接近球形，粒徑比較均一，具有較窄的粒徑柱狀分布圖，平均粒徑為3.42nm。由圖2中的B中可知，該MoO₃材料的晶格間距為0.185nm，與標(biāo)準(zhǔn)的JCPDS圖對(duì)應(yīng)的（500）晶面的晶格間距0.1824nm很接近。

實(shí)施例2：

一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片的檢測(cè)步驟如下：

在紙微流控芯片上依次滴加6μL 磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0) 中依次加入2μL MoO₃、1μLABTS（10^-3 mol/L）和1μL一系列H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)液，及抗壞血酸刺激PC12細(xì)胞后樣品，濃度為10^-6 、5×10^-6 、10^-5、5×10^-4、10^-4、5×10^-3、10^-3、5×10^-2、10^-2mol/L，在暗箱里控制相同的光照條件和溫度，反應(yīng)10min中后用單反相機(jī)拍照成像，將得到的圖像用ImageJ軟件讀取顯色區(qū)域的灰度值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的灰度值差，得到顯色平均強(qiáng)度，從而根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)H₂O₂定量分析。

如圖3所示，顯色強(qiáng)度與H₂O₂ 濃度對(duì)數(shù)響應(yīng)曲線（ΔG= |G- G₀| ，G 為在顯色體系中含有不同濃度H₂O₂ 的灰度值，G₀ 為顯色體系中不加H₂O₂時(shí)的灰度值），H₂O₂濃度在1 μmol/L~10mmol/L 范圍內(nèi)，顯色體系的顯色強(qiáng)度ΔG與logH₂O₂ 濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9909），線性方程為ΔG=14.6954logC_H2O2 + 74.1004，檢測(cè)限為0.52 μmol/L。

實(shí)施例3：

一種用于納米氧化鉬模擬酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的紙微流控芯片的檢測(cè)步驟如下：

當(dāng)PC12細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底鋪滿后，傾倒出培養(yǎng)基。加入磷酸鹽緩沖液，吹打懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液5 mL（～5×10⁷cells/mL），，并加入5 μL 10^-3 mol/L 抗壞血酸，混合均勻，5 min后離心，收集離心上清液，加入到制備好的紙微流控芯片中，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的H₂O₂，如圖4所示。