一種抑制細(xì)胞色素p450基因表達(dá)的載體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的RNAi植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，以及，一種干擾植物細(xì)胞色素P450基因CYP81A6表達(dá)的方法和獲得除草劑顯性敏感植物的方法。將RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，能夠成功抑制基因CYP81A6的表達(dá)，并將水稻從對(duì)除草劑具有抗性轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾?，從而培育了一種對(duì)除草劑顯性敏感的水稻。使得敏感植株可以通過(guò)施用除草劑的方式被清除。該水稻在培育轉(zhuǎn)基因新品種，雜交水稻制種，防止轉(zhuǎn)基因逃逸等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種抑制細(xì)胞色素 P450基因表達(dá)的載體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制細(xì)胞色素 P450基因表達(dá)的RNAi 植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)重要手段之一。水稻是全世界最重要的糧食作物 之一，具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。中國(guó)是世界上首個(gè)成功實(shí)現(xiàn)雜交水稻商品化生產(chǎn)的國(guó)家，雜交 水稻使我國(guó)水稻產(chǎn)量提高了20%，全國(guó)雜交水稻常年種植面積已超過(guò)水稻年播種面積的 50%。"三系法"和"兩系法"是目前雜交水稻制種的主要方法，但由于三系核質(zhì)互作的基因 型限制及兩系的光溫敏在特殊條件下的不穩(wěn)定，雜交水稻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展已受到制約。美國(guó)先 鋒公司的SPT技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功解決了雜交制種中的一系列問(wèn)題，并于2012年在玉 米中實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，水稻雜交制種也極有可能利用類似SPT技術(shù)實(shí)現(xiàn)更新?lián)Q代。同時(shí)，轉(zhuǎn) 基因技術(shù)在各種農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。然而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品自誕生之日起產(chǎn)生的爭(zhēng) 議，至今仍甚囂塵上。因此，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品需要加以嚴(yán)格的控制和監(jiān)管，防止轉(zhuǎn)基因漂移污染 其他品種甚至其他物種就顯得尤為重要。
[0003] 因此，需要建立一種能夠定向清除雜交種子或轉(zhuǎn)基因植株的機(jī)制。培育獲得除草 劑敏感的不育系是解決問(wèn)題的有效手段之一。
[0004] 苯達(dá)松(bentazon)是一種苯并噻二唑類除草劑，屬雜環(huán)類選擇性化學(xué)除草劑，多 數(shù)闊葉類雜草和莎草科雜草對(duì)苯達(dá)松敏感，而包括水稻在內(nèi)的禾本科和豆科植物則對(duì)其有 較強(qiáng)的耐藥性，苯達(dá)松具有廣譜，高效，低毒的特性。因此，苯達(dá)松用于清除稻田的闊葉類雜 草和莎草科雜草十分有效，而對(duì)水稻又十分安全(張集文(2010)水稻苯達(dá)松敏感突變研究 進(jìn)展.中國(guó)水稻科學(xué)24 : 551-558)。水稻對(duì)苯達(dá)松抗性由一個(gè)單隱性基因細(xì)胞色素 P450 (CYP81A6)控制，該基因位于水稻第3號(hào)染色體上，參與苯達(dá)松在植物體內(nèi)的羥基化脫毒過(guò) 程。苯達(dá)松敏感型突變體"如^118111"、180773"、"嘉浙1^"、"62 11113"和"62 11123"等都是由 于CYP81A6基因突變?cè)斐傻?。CYP81A6基因的突變，導(dǎo)致上述突變體無(wú)法在體內(nèi)降解苯達(dá)松， 從而導(dǎo)致噴施苯達(dá)松除草劑時(shí)，植物死亡。同時(shí)，該細(xì)胞色素 P450也是磺酰脲類除草劑的作 用靶標(biāo)，包含CYP81A 6突變基因或苯達(dá)松敏感的植物，在噴施磺酰脲類除草劑時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致 死亡。
[0005] 因此，有必要開(kāi)發(fā)出一種能夠有效的影響水稻細(xì)胞色素 P450(CYP81A6)表達(dá)的技 術(shù)手段，從而為雜交水稻制種、培育轉(zhuǎn)基因新品種、防止轉(zhuǎn)基因逃逸等方面提供有效管控方 案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效的影響水稻細(xì)胞色素 P450(CYP81A6)表達(dá)的植 物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法：
[0007] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)胞色素 P450基因表達(dá)的RNAi植物表達(dá) 載體，含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒，其中所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒含有由SEQ ID No. 1-3所示的DNA片 段所形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0008] 其中，SEQ ID No.l所示的DNA片段為基于CYP81A6的長(zhǎng)度為471bp的正向DNA片段， SEQIDNo.3所示的DNA片段為基于CYP81A6的長(zhǎng)度為471bp的與SEQIDNo.l所示的DNA片 段反向互補(bǔ)的DNA片段。SEQ ID No.2為來(lái)自水稻Zinc finger基因的內(nèi)含子序列（Rice intron)〇
[0009] SEQ ID No.l至3所示的DNA片段按照從上游到下游的方向依次排列。該發(fā)夾表達(dá) 盒可在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成發(fā) 卡的"環(huán)"，SEQ ID No.l和3所示的DNA片段互補(bǔ)形成發(fā)卡的"莖"。
[0010] 其中，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒還包括位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)上游的植物組成型啟動(dòng)子或植物 組織特異性啟動(dòng)子，以及，位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)下游的終止子。
[0011] 其中所述植物組成型啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子、CAMV 35S啟動(dòng)子或Actin 啟動(dòng)子;所述植物組織特異性啟動(dòng)子為Rubisco小亞基啟動(dòng)子或Cab啟動(dòng)子。優(yōu)選的，當(dāng)啟動(dòng) 子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子時(shí)，能夠取得非常強(qiáng)的干擾CYP81A6基因表達(dá)的效果。
[0012] 所述終止子包括:N0S終止子，Ubi終止子等在植物中可以終止基因轉(zhuǎn)錄的DNA序 列。優(yōu)選的，所述終止子為N0S終止子。
[0013] 所述RNAi植物表達(dá)載體還包括選擇標(biāo)記表達(dá)盒，所述選擇標(biāo)記表達(dá)盒含有啟動(dòng) 子、標(biāo)記基因和終止子，其中所述啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子，CAMV 35S啟動(dòng)子或 Actin啟動(dòng)子，優(yōu)選的，當(dāng)啟動(dòng)子為CAMV 35S啟動(dòng)子時(shí)，能夠取得良好的驅(qū)動(dòng)選擇標(biāo)記基因 在植物中超量表達(dá)的效果。所述終止子為N0S終止子或Ub i終止子，優(yōu)選為N0S終止子。
[0014] 所述標(biāo)記基因?yàn)榭僧a(chǎn)生顏色變化的酶的基因（如⑶S基因、熒光素酶基因等）、熒光 標(biāo)記基因（如熒光蛋白基因）、抗生素標(biāo)記基因（可供篩選的抗生素標(biāo)記如潮霉素、慶大霉 素、卡那霉素基因）、除草劑篩選標(biāo)記基因（如抗草甘膦基因、抗雙草醚基因等)或抗化學(xué)試 劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因等）。特別優(yōu)選的，所述標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾鼗颉?br>[0015] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的RNAi植物表達(dá)載體是將SEQ ID No.l 所示的DNA片段插入到植物雙元轉(zhuǎn)化載體pTCK303的BamH I和Cla I位點(diǎn)間，得到中間載體 l;再將SEQIDNo.3所示的DNA片段插入到所述中間載體l的KpnI、XholI位點(diǎn)間，所得到 的RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-P450i-3。
[0016] 特別優(yōu)選的，所述的RNAi植物表達(dá)載體，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0017] 其中，所述植物為水稻，優(yōu)選的，所述植物為轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0018] 值得注意的是，用于RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建的中間載體和具有選擇標(biāo)記基因的 RNAi表達(dá)載體，工程菌及包含P450i-3莖環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞、愈傷組織、轉(zhuǎn)基因苗、種子等均屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了一種RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述方法包 括:將SEQ ID No.l所示的DNA片段插入到植物雙元轉(zhuǎn)化載體pTCK303的BamH I和Cla I位點(diǎn) 間，得到中間載體l;將SEQIDN0.3所示的DNA片段插入到所述中間載體l的KpnI、Xh 0lI 位點(diǎn)間，得到RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-P450i-3。
[0020] 具體的，所述方法可以按照以下步驟進(jìn)行：
[0021] (1)設(shè)計(jì)引物，正向引物所帶酶切位點(diǎn)為Κρη I和Cla I，反向引物所帶酶切位點(diǎn)為 Xho1 I和BamH I。
[0022] P450RNAi-F3 GGGGTACCATCGATCGCATCCGTCGGCAAC
[0023] P450RNAi-R3 CCGCTCGAGGGATCCGGCCTGCACATGGCCT
[0024] (2)RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0025] 以水稻cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增P450i-3基因片段。擴(kuò)增體系及程 序如下：
[0026] 程序：94°(：預(yù)變性5-1〇111丨11，94°(：變性3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,3〇-35個(gè)循 環(huán)，72°C再延伸30s;16°C結(jié)束。
[0028] 獲得PCR產(chǎn)物片段，回收后，連接pMD18-T載體(Takara)，命名為pMD18-T-P450i-3。 采用的植物雙元轉(zhuǎn)化載體為PTCK303,按照酶切位點(diǎn)，分別切pTCK303載體及pMD18-T-P450i-3,將內(nèi)切（酶切位點(diǎn)為BamH I、Cla I)獲得的目的片段連入pTCK303載體的Rice Intron(SEQ ID No.2所示序列）一端，將該載體命名為pTCK303-P450i-3a。以pTCK303-p450i-3a為載體，按照酶切位點(diǎn)，分別切pTCK303-P450i-3a與pMD18-T-P450i-3，將外切（酶 切位點(diǎn)為Kpn I、Xho I)獲得的目的片段連入pTCK303-P450i-3a載體的Rice Intron另一 端，獲得載體 pTCK303-P450i-3。
[0029]本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的RNAi植物表達(dá)載體在干擾植物細(xì)胞色素 P450 基因 CYP81A6表達(dá)制備除草劑顯性敏感植物中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的RNAi植物表達(dá)載體可通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通 道法等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
[0031] 優(yōu)選的，所述應(yīng)用包括將pTCK303-P450i-3導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，并轉(zhuǎn)化愈傷組 織。所述愈傷組織可以為花藥誘導(dǎo)的愈傷組織、成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織、幼胚誘導(dǎo)的愈傷組 織、幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織。
[0032]本發(fā)明的一個(gè)方面還提供了一種獲得除草劑顯性敏感植物的方法，包括將所述 RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，干擾植物細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6表達(dá)。
[0033]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述獲得除草劑顯性敏感植物的方法包括：
[0034] (1)構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體:將SEQ ID No. 1所示的DNA片段插入到植物雙元轉(zhuǎn)化 載體PTCK303的BamH I和Cla I位點(diǎn)間，得到中間載體1;將SEQ ID如.3所示的0嫩片段插入 到所述中間載體1的Kpn I、Xhol I位點(diǎn)間，得到RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-P450i-3;
[0035] (2)轉(zhuǎn)化:將pTCK303-P450i-3導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，并轉(zhuǎn)化愈傷組織，將轉(zhuǎn)化后 的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化獲得除草劑顯性敏感植物。
[0036] 其中，所述RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-P450i-3具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序 列。
[0037] 其中，所述除草劑可以為苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑。所述植物為水稻，優(yōu)選的，所 述植物為轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0038] 本發(fā)明利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)針對(duì)水稻細(xì)胞色素 P450(CYP81A6)的植物雙元 轉(zhuǎn)基因載體。將該載體轉(zhuǎn)化水稻，成功抑制了該基因的表達(dá)，并將水稻從對(duì)苯達(dá)松或磺酰脲 類除草劑具有抗性轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾?，從而培育了一種對(duì)苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑顯性敏感的水 稻。使得轉(zhuǎn)基因植株可以通過(guò)施用除草劑的方式被清除。該水稻在培育轉(zhuǎn)基因新品種，雜交 水稻制種，防止轉(zhuǎn)基因逃逸等方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為P450i-3 RNAi載體的構(gòu)建流程圖
[0040] 圖2為pTCK303-P450i-3 RNAi載體經(jīng)BamH I和Xhol I雙酶切的電泳圖。圖中1為未 酶切的重組質(zhì)粒，圖中2為酶切的重組質(zhì)粒，Μ為D15 0 0 0 m a r k e r，所切出的片段大小為 1432bp，包括目的片段的正向、反向互補(bǔ)序列及水稻內(nèi)含子序列。
[0041] 圖3為轉(zhuǎn)基因株系潮霉素抗性基因 PCR檢測(cè)電泳圖；1，H20;2,陰性對(duì)照（中花11非 轉(zhuǎn)基因植株）；3，陽(yáng)性對(duì)照;4-20，轉(zhuǎn)基因敏感株系;Μ，Marker。
[0042] 圖4為pTCK303-P450i-3轉(zhuǎn)基因 TO代三葉期幼苗對(duì)0.25g/L苯達(dá)松溶液敏感度測(cè) 試?？菸劳龅木鶠槊舾兄晗?。
[0043] 圖5為pTCK303-P450i-3轉(zhuǎn)基因幼苗細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6的表達(dá)量。其中WT 為中花11作為陰性對(duì)照，其余為轉(zhuǎn)基因株系。
[0044] 圖6對(duì)比例1中苯達(dá)松敏感的P450i轉(zhuǎn)基因株系T0代3-5葉期幼苗對(duì)10g/L以上濃度 苯達(dá)松溶液敏感度測(cè)試。其中22、23、24、60為獨(dú)立?450丨轉(zhuǎn)基因株系
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0046] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0047] 實(shí)施例1菌株、質(zhì)粒的獲得及PCR引物的合成
[0048] (1)菌株和質(zhì)粒
[0049]作為骨架載體的植物雙元轉(zhuǎn)化載體PTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi啟動(dòng)子 及N0S終止子;pMD18_T克隆載體(Takara)。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株為DH5a;農(nóng)桿 菌(Agrobacterim tumefacieus)菌株為EHA105。
[0050] (2)PCR引物序列
[00511 設(shè)計(jì)正向引物所帶酶切位點(diǎn)為Κρη I和Cla I，反向引物所帶酶切位點(diǎn)為Xhol I和 BamH I0
[0052] P450RNAi-F3 GGGGTACCATCGATCGCATCCGTCGGCAAC
[0053] P450RNAi-R3 CCGCTCGAGGGATCCGGCCTGCACATGGCCT
[0054]實(shí)施例2RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0055] 為了構(gòu)建細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6的干擾載體，以水稻cDNA為模板，利用實(shí)施例 1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增P450i-3基因片段。擴(kuò)增體系及程序如下：
[0056]程序：94°(：預(yù)變性5-1〇111丨11，94°(：變性3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,3〇-35個(gè)循 環(huán)，72°C再延伸30s;16°C結(jié)束。
[0059]擴(kuò)增出471 bp與預(yù)期大小相符的基因片段，回收后，連接pMD 18-T載體(Takara)，命 名為pMD18-T-P450i-3,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證片段序列正確。采用的植物雙元轉(zhuǎn)化載體為pTCK303(如 圖1A所示），按照酶切位點(diǎn)，分別切pTCK303載體及pMD 18-T-P450i-3，將內(nèi)切（酶切位點(diǎn)為 BamH I、Cla I)獲得的目的片段連入pTCK303載體的Rice Intron-端（圖1B所示），連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切，目的片段大小符合預(yù)期，該載體命名為 pTCK303-P450i-3a。以 pTCK303-P450i-3a 為載體，按照酶切位點(diǎn)，分別切 pTCK303-P450i-3a 與pMD18-T-P450i-3,將外切(酶切位點(diǎn)為Kpn I、Xhol I)獲得的目的片段連入pTCK303載體 的Rice Intron另一端（圖1C)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I 和Xhol I雙酶切，目的片段大小符合預(yù)期（圖2)，并將重組子送測(cè)序驗(yàn)證正確，即為以Rice Intron為環(huán)，構(gòu)建的P450i-3 RNAi載體，將此載體命名為pTCK303-P450i-3。
[0060]實(shí)施例3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻及轉(zhuǎn)基因植株鑒定
[0061 ] 將pTCK303-P450i-3重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，并轉(zhuǎn)化粳稻中花11愈傷組 織，經(jīng)潮霉素抗性篩選，分化，生根獲得再生轉(zhuǎn)基因株系25株，通過(guò)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn) 入的潮霉素抗性基因，結(jié)果顯示，PCR陽(yáng)性植株20株（圖3)，將陽(yáng)性植株移栽至泥土中，成活 17株。
[0062]實(shí)施例4水稻苯達(dá)松敏感與抗性轉(zhuǎn)基因株系的獲得
[0063]為了檢測(cè)所設(shè)計(jì)干擾載體片段在轉(zhuǎn)基因植株中的效果，用48%苯達(dá)松母液(常州 精度生物科技有限公司）配制〇.25g/L苯達(dá)松溶液，噴施pTCK303-P450i-3轉(zhuǎn)基因 T0代三葉 期幼苗，按l〇〇ml/m2計(jì)算，噴施量為0.01-0.05g/m2，噴后連續(xù)觀察。噴施后4d，P450i-3轉(zhuǎn)基 因 TO代幼苗部分株系葉片葉尖卷曲枯黃;噴施后7d，P450i-3轉(zhuǎn)基因 17個(gè)株系中，有10個(gè)株 系出現(xiàn)不可逆死亡，屬于高度敏感株系;有3個(gè)株系之前葉片枯萎嚴(yán)重但逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)，屬 于中度敏感株系;還有4個(gè)株系噴施前后無(wú)明顯變化，屬于抗性株系（圖4)。需要強(qiáng)調(diào)的是， 雖然本實(shí)施例用〇.25g/L苯達(dá)松噴施篩選苯達(dá)松敏感轉(zhuǎn)基因株系，但篩選敏感株系并不限 于0.25g/L，0.1g/L為本發(fā)明所應(yīng)用的苯達(dá)松最低濃度。以上結(jié)果表明，我們成功獲得了除 草劑顯性敏感的轉(zhuǎn)基因材料。
[0064] 實(shí)施例5細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6表達(dá)量的檢測(cè)
[0065] 為了進(jìn)一步確定干擾載體片段所導(dǎo)致的除草劑顯性敏感，是由于其對(duì)細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6的抑制造成的，我們檢測(cè)了CYP81A6基因的表達(dá)量。分別取轉(zhuǎn)基因敏感株 系、中度敏感株系、抗性株系葉片各2個(gè)株系，以中花11作為陰性對(duì)照，提取總RNA，并進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。在Thermo PikoReal96實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè) CYP81A6基因的表達(dá)。反應(yīng)體系及程序如下：
[0066] RT-PCR 引物序列：
[0068]熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序如下：
[0069] 程序:94°C預(yù)變性7min，94°C變性15s，55°C退火158;72°(：延伸158(熒光檢測(cè)）；40 個(gè)循環(huán);60 °C保溫，30s。溶解曲線程序:60-95 °C (每升高0.2 °C，保持1 s); 20 °C保溫，10s;結(jié) 束。
[0071] 程序:94°C預(yù)變性7min，94°C變性15s，55°C退火158;72°(：延伸158(熒光檢測(cè)）；40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序:60-95°C (每升高0.2°C，保持1 s); 20°C保溫，1 Os;結(jié)束。
[0073]熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的熔解曲線峰均為單一峰形，形 狀銳利。提示各樣品熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，未見(jiàn)非特異的雙鏈DNA產(chǎn)物或引物 二聚體。擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S形曲線形狀完好，符合定量檢測(cè)要求。采用比 較閥值法（2-^巧去）進(jìn)行相對(duì)定量（Liva K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and 2(_Delta Delta C (T))Method[J].Methods，2001,25(4) :402-408.)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因敏感株系中CYP81A6基 因的表達(dá)劇烈下調(diào)，僅為野生型對(duì)照的6 %-7 %，說(shuō)明P450i-3干擾片段對(duì)CYP81A6基因的表 達(dá)有極強(qiáng)的抑制作用（圖5，敏感株系7-2、敏感株系38-2代表不同的轉(zhuǎn)基因株系）；中度敏感 株系中CYP81A6基因的表達(dá)也顯著下調(diào)，約為野生型對(duì)照的30%-41%左右，對(duì)CYP81A6基因 的表達(dá)也起到顯著的抑制作用（圖5,中度敏感株系76-2、中度敏感株系80-2代表不同的轉(zhuǎn) 基因株系）；但抗性株系中，該基因表達(dá)并未呈現(xiàn)明顯變化（圖5、抗性株系6-2和抗性株系 50-2代表不同的轉(zhuǎn)基因株系）<XYP81A6基因在對(duì)照和各轉(zhuǎn)基因敏感、中度敏感、抗性株系中 的表達(dá)與這些株系對(duì)苯達(dá)松的敏感程度相吻合，表明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)苯達(dá)松的敏感的確是由 于CYP81A6基因的表達(dá)下調(diào)造成的。以上結(jié)果表明，P450i-3干擾片段及pTCK303-P450i-3的 植物雙元轉(zhuǎn)化載體可成功用于抑制細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6的表達(dá)，并培育除草劑顯性 敏感的材料。
[0074]實(shí)施例6敏感株系各生育期對(duì)苯達(dá)松的敏感度測(cè)試
[0075]為了檢測(cè)顯性敏感株系在不同生育期對(duì)苯達(dá)松的敏感程度，在不同生育期對(duì)其進(jìn) 行苯達(dá)松臨界濃度測(cè)試。
[0076]以野生型ΖΗ11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系苗期（五葉期之前）噴施苯達(dá)松溶液 0.01-0.2g/m2，噴施后連續(xù)觀察，10d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常 生長(zhǎng)。
[0077]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系初分蘗期噴施苯達(dá)松溶液0.25-0.5g/ m2，噴施后連續(xù)觀察，10d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0078]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系最大分蘗期噴施苯達(dá)松溶液0.5-0.65g/ m2，噴施后連續(xù)觀察，10d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0079]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系孕穗期噴施苯達(dá)松溶液0.65-0.8g/m2， 噴施后連續(xù)觀察，l〇d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0080]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系苗抽穗期噴施苯達(dá)松溶液0.8-1.2g/m2， 噴施后連續(xù)觀察，l〇d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0081 ]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系開(kāi)花后7d噴施苯達(dá)松溶液1.2-1.8g/m2， 噴施后連續(xù)觀察，l〇d~15d后，敏感株系出現(xiàn)不可逆死亡，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0082] 實(shí)施例7敏感株系各生育期對(duì)磺酰脲類除草劑的敏感度測(cè)試
[0083] 為了檢測(cè)顯性敏感株系在不同生育期對(duì)磺酰脲類除草劑的敏感程度，我們?cè)诓煌?生育期對(duì)其進(jìn)行磺酰脲類除草劑如芐嘧磺隆臨界濃度測(cè)試。
[0084]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系苗期(五葉期之前)噴施芐嘧磺隆溶液1-5mg/m2，噴施后連續(xù)觀察，5d~10d后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0085]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系初分蘗期噴施磺芐嘧磺隆溶液5-15mg/ m2，噴施后連續(xù)觀察，5d~10d后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0086]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系最大分蘗期噴施芐嘧磺隆溶液15-20mg/ m2，噴施后連續(xù)觀察，5d~10d后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0087]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系孕穗期噴施芐嘧磺隆溶液20-35mg/m2， 噴施后連續(xù)觀察，5d~10d后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0088]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系抽穗期噴施芐嘧磺隆溶液35-40mg/m2， 噴施后連續(xù)觀察，5d~10d后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0089]以野生型ZH11作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因敏感株系開(kāi)花后7d噴施芐嘧磺隆溶液40-50mg/ m2，噴施后連續(xù)觀察，5d~lOd后，敏感株系出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，但野生型卻正常生長(zhǎng)。
[0090] 對(duì)比例1
[0091] 按照Lin等先前報(bào)道的方法（Lin C，F(xiàn)ang J，Xu X，Zhao T，Cheng J，Tu J，Ye G， Shen Z(2008)A built-in strategy for containment of transgenic plants:creation of selectively terminable transgenic rice.PLoS One 3:el818)構(gòu)建發(fā)卡結(jié)構(gòu)并利用 中花11制備獲得苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因株系。
[0092] 對(duì)苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因株系分別噴施濃度為0.5g/L和1 g/L的苯達(dá)松，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi) 有任何一棵轉(zhuǎn)基因株系被殺死。當(dāng)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系噴施l〇g/L以上濃度苯達(dá)松時(shí)才有表型，且 苯達(dá)松敏感的表型率較低，表明按照此方法設(shè)計(jì)的P450 i對(duì)內(nèi)源基因的干擾效率較低。苯達(dá) 松敏感的P450i轉(zhuǎn)基因株系T0代3-5葉期幼苗對(duì)10g/L以上濃度苯達(dá)松溶液敏感度測(cè)試結(jié)果 見(jiàn)圖6,圖6中22、23、24和60代表不同的株系的編號(hào)。
[0093]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抑制細(xì)胞色素 P450基因表達(dá)的RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于，含有發(fā)卡結(jié)構(gòu) 表達(dá)盒，其中所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒含有由SEQ ID No. 1-3所示的DNA片段所形成的發(fā)卡結(jié) 構(gòu)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒還包括 位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)上游的植物組成型啟動(dòng)子或植物組織特異性啟動(dòng)子，以及，位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)下 游的終止子， 其中所述植物組成型啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子、CAMV 35S啟動(dòng)子或Actin啟動(dòng) 子;所述植物組織特異性啟動(dòng)子為Rub i s co小亞基啟動(dòng)子或Cab啟動(dòng)子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于，還包括選擇標(biāo)記表達(dá)盒，所 述選擇標(biāo)記表達(dá)盒含有啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和終止子，其中所述啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟 動(dòng)子、CAMV 35S啟動(dòng)子，或Actin啟動(dòng)子;所述標(biāo)記基因?yàn)榭僧a(chǎn)生顏色變化的酶的基因、熒光 標(biāo)記基因、抗生素標(biāo)記基因、除草劑篩選標(biāo)記基因或抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因，所述終止子為 NOS終止子或Ub i終止子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于，具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。5. -種RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括:將SEQ ID No. 1所 示的DNA片段插入到植物雙元轉(zhuǎn)化載體pTCK303的BamH I和Cla I位點(diǎn)間，得到中間載體1; 將SEQ ID No.3所示的DNA片段插入到所述中間載體1的Kpn I、Xhol I位點(diǎn)間，得到RNAi植 物表達(dá)載體 pTCK303-P450i-3。6. 權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的RNAi植物表達(dá)載體在干擾植物細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6表達(dá)制備除草劑顯性敏感植物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將pTCK303-P450i-3導(dǎo)入農(nóng)桿菌 EHAl 05菌株，并轉(zhuǎn)化植物愈傷組織。8. -種獲得除草劑顯性敏感植物的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng) 所述的RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，干擾植物細(xì)胞色素 P450基因 CYP81A6表達(dá)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括： (1) 構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體:將SEQ ID No. 1所示的DNA片段插入到植物雙元轉(zhuǎn)化載體 PTCK303的BamH I和Cla I位點(diǎn)間，得到中間載體1;將SEQ ID No.3所示的DNA片段插入到所 述中間載體1的Kpn I、Xhol I位點(diǎn)間，得到RNAi植物表達(dá)載體pTCK303-P450i-3; (2) 轉(zhuǎn)化:將pTCK303-P450i-3導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，并轉(zhuǎn)化愈傷組織，將轉(zhuǎn)化后的愈 傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化獲得除草劑顯性敏感植物。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105886526SQ201610249721
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】黃培勁, 安保光, 歐陽(yáng)超, 陳思蘭, 吳永忠
【申請(qǐng)人】海南波蓮水稻基因科技有限公司