本發(fā)明屬于檢測(cè)受體與抗體相互作用領(lǐng)域,特別涉及一種芳香烴受體與其介導(dǎo)的抗體的免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)定義為含有2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)的一類碳?xì)浠衔?,種類眾多。美國(guó)環(huán)保局(usepa)把萘(naphthalene,nap),苊(acenaphthene,ana),苊烯(acenaphthylene,ny)、芴(fluorene,flu)、蒽(anthracene,ant)、菲(phenanthrene,phe)、熒蒽(fluoranthene,flt),芘(pyrene,pyr)、苯并[a]蒽[benzo(a)anthracene,baa]、
免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原間的高選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一種生物化學(xué)分析法,其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)是利用抗原-抗體的特異性與酶催化作用的高效性并將二者相結(jié)合,通過(guò)酶的催化作用于底物后的顯色反應(yīng)判定結(jié)果,是目前應(yīng)用最為廣泛的綜合性免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種芳香烴受體與其介導(dǎo)的抗體的免疫檢測(cè)方法,本發(fā)明中提供了一種芳香烴受體,并建立與其介導(dǎo)的抗體的免疫檢測(cè)方法,該受體與配體的結(jié)合特異性好,可以與ahr抗體對(duì)水體痕量pahs進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,樣品用量少,可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
本發(fā)明的一種芳香烴受體與其介導(dǎo)的抗體的免疫檢測(cè)方法,包括:
(1)取喂養(yǎng)于含多環(huán)芳烴pahs水中的鯉魚的肝臟,清洗后吸干水分,然后加入hedg緩沖液勻漿,離心取上清,得到粗提取的ahr,純化,得到芳烴受體ahr;
(2)將ahr溶液中加入pahs溶液,混勻后靜置于4℃條件下放置30min,得到免疫抗原pahs-ahr;
(3)向96孔酶標(biāo)板中每孔加入pahs-ahr稀釋液100μl,4℃包被12h,倒出孔內(nèi)液體,用洗滌液振蕩洗滌,拍干,每孔加封閉液200μl,37℃封閉60min,倒出孔內(nèi)液體,洗滌,拍干,每孔加入一抗稀釋液50μl和不同濃度的pahs溶液50μl,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,于37℃溫育60min,重復(fù)上述洗滌步驟,拍干待用,每孔加入酶標(biāo)二抗稀釋液100μl于37℃溫育60min,重復(fù)上述洗滌步驟,拍干待用,每孔加入tmb100μl底物溶液,室溫下顯色15min,每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),采用酶標(biāo)儀測(cè)定od值;以pahs濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
抑制率(%)=(1-b/b0)×100%;(b=od450-od630下同)
樣品測(cè)定:水樣用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至6-8,取50μl,同上述pahs溶液進(jìn)行測(cè)定;較為渾濁的水樣先稀釋后再調(diào)ph進(jìn)行測(cè)定。
所述步驟(1)中肝臟和hedg緩沖液勻漿的比例為1g:4ml;hedg緩沖液為25mmol·l-1hepes,1mmol·l-1edta,1mmol·l-1dtt,10%甘油,調(diào)ph7.5。
所述步驟(1)中純化為采用離子交換層析法進(jìn)行純化。
采用離子交換層析法進(jìn)行純化具體為:選取取適量(溶脹后足夠填滿層析柱)大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系樹(shù)脂,進(jìn)行預(yù)處理:用超純水沖洗樹(shù)脂,除去懸浮及機(jī)械雜質(zhì)、細(xì)碎樹(shù)脂,趕盡氣泡,同時(shí)樹(shù)脂體積膨脹,不間斷沖洗直到流出的水質(zhì)清晰透明,樹(shù)脂層之間不存在氣泡,然后用10%的食鹽水浸泡樹(shù)脂20h,再漂洗干凈,再用1mol/l的鹽酸浸泡樹(shù)脂6h,用清水漂凈,此時(shí)ph約為6,最后用1mol/l的naoh溶液浸泡樹(shù)脂6h,再漂洗至中性;裝柱:將玻璃層析柱(長(zhǎng)50cm,內(nèi)徑1cm)洗凈后垂直安裝于支架上,裝入a液約50ml,打開(kāi)下嘴閥使緩沖液緩慢滴出,同時(shí)將懸浮于適量洗脫液a中經(jīng)預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂一邊攪動(dòng)一邊倒入層析柱中,使其自然沉降到全部加入為止,此過(guò)程中需保證柱床不分層,柱面平整,柱中無(wú)氣泡。待液面高出樹(shù)脂填料沉降面約1cm時(shí),關(guān)閉下嘴閥;平衡:連接梯度混合器,打開(kāi)恒流泵,用起始緩沖液(洗脫液a)以1.0ml/min的流速平衡柱子,直到流出液ph與起始緩沖液ph相同為止;將步驟(1)中得到的粗提取的ahr用a液平衡過(guò)夜后滴加到樹(shù)脂表面上,滴加完全后再滴加hedg緩沖液至液面高過(guò)樹(shù)脂1cm,開(kāi)始進(jìn)行洗脫:蓋緊層析柱上蓋,將流速調(diào)整為2.0ml/min,然后連接并打開(kāi)梯度混合器開(kāi)始洗脫,調(diào)節(jié)流動(dòng)相由100%a液變?yōu)?00%b液,用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)a280,部分收集器收集流出的組分,收集純化后的受體并用傅里葉紅外光譜進(jìn)行鑒定;其中a液為20mmol·l-1的tea;b液為tea20mmol·l-1,nacl500mmol·l-1。
所述步驟(2)中ahr溶液的溶劑為pbs緩沖液,其中pbs緩沖液為0.01m磷酸鹽緩沖液,調(diào)ph為7.4;pahs溶液的溶劑為10%體積的丙酮溶液。
所述步驟(2)中ahr與pahs混合液中ahr濃度為1mg·ml-1,pahs濃度為10-5mg·ml-1。
所述步驟(3)中pahs-ahr稀釋液為(2)中ahr與pahs混合液稀釋2000倍,稀釋液的溶劑為0.05m碳酸鹽緩沖液;洗滌液為pbs-t,為用pbs配置的體積比0.5‰的tween-20;封閉液的配置方法為:稱取1g明膠,用pbs定容到100ml;終止液為2m硫酸溶液。
步驟(3)中一抗為ahr抗體,稀釋濃度為0.275μg·ml-1;酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔igg,稀釋濃度為0.1μg·ml-1。
所述步驟(3)中一抗稀釋溶劑為pbs配置的1g·l-1的ahr,二抗稀釋溶劑為pbs。
所述步驟(3)中不同濃度的pahs為10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml系列濃度(采用10%的丙酮配制)。
所述步驟(3)中tmb底物溶液配置方法為:稱取tmb10mg,加入4ml乙醇溶解,得到tmb儲(chǔ)存液;使用時(shí),取tmb儲(chǔ)存液0.4ml,底物緩沖液(2.1%的檸檬酸2.43ml和3.04%磷酸氫二鈉2.57ml,定容至10ml,調(diào)ph至5.0,臨用現(xiàn)配)10ml和30%h2o210μl,混合均勻,該試劑需臨用現(xiàn)配。
本發(fā)明從鯉魚肝臟中分離并純化的芳香烴受體與pahs(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)結(jié)合制備包被抗原吸附在固相載體(酶標(biāo)板)上,然后加入待測(cè)pahs樣品、ahr和相應(yīng)抗體,固相上的pahs-ahr和待測(cè)pahs-ahr與抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),反應(yīng)后加入酶標(biāo)二抗,最后用底物顯色加以測(cè)定。根據(jù)已知pahs的標(biāo)準(zhǔn)系列和待測(cè)樣品的od值,根據(jù)od值與pahs濃度之間的對(duì)數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線,并推算出待測(cè)pahs的濃度。
有益效果
本發(fā)明提供了一種芳香烴受體,并建立與其介導(dǎo)的抗體的免疫檢測(cè)方法,該受體與配體的結(jié)合特異性好,可以與ahr抗體對(duì)水體痕量pahs進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,樣品用量少,可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例1的芳香烴受體的紫外掃描圖譜;
圖2為實(shí)施例1的ahr在280nm下的分離檢測(cè)譜圖;
圖3為實(shí)施例1的芳香烴受體的sds-page電泳圖譜;
圖4為實(shí)施例1的芳烴香受體與蒽作用前后的紅外光譜圖;
圖5為實(shí)施例2的間接競(jìng)爭(zhēng)elisa方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
一、鯉魚體內(nèi)芳香烴受體(ahr)的分離與純化
1.含ahr的細(xì)胞溶質(zhì)的提取
取馴養(yǎng)于含ant的水中的鯉魚肝臟,先用生理鹽水將肝臟表面血液清洗干凈,再將表面水分吸干,稱重,再以質(zhì)量體積比為1g:4ml的比例加入hedg緩沖液進(jìn)行研磨,獲得肝組織勻漿(以上操作均在冰上進(jìn)行)。勻漿液于13000rmp,4℃下離心1h,吸取上清,即為含有受體的細(xì)胞溶質(zhì)。可于-80℃保存也可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
2.ahr的分離純化
使用離子交換層析法純化蛋白質(zhì)。將樣品用起始緩沖液平衡過(guò)夜,用滴管將樣品沿管壁小心加到樹(shù)脂的表面上,打開(kāi)下嘴閥,待樣品液面完全進(jìn)入樹(shù)脂表面時(shí),關(guān)閉下嘴閥。用同樣方法滴加起始緩沖液至在柱面上覆蓋一層約1~2cm厚的起始緩沖液,將流速調(diào)整為2.0ml/min,然后連接并打開(kāi)梯度混合器開(kāi)始洗脫,調(diào)節(jié)梯度由100%a液變?yōu)?00%b液,采用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)280nm處的光吸收值,并用部分收集器收集流出的組分,即為純化過(guò)的ahr。
二、ahr與ant偶聯(lián)與鑒定
將提純后的適量受體樣品溶于pbs緩沖液中配制ahr溶液,向ahr溶液中加入ant的丙酮溶液并作為實(shí)驗(yàn)組,以未加入ant的ahr溶液為對(duì)照組,均保持二者溶液中ahr的濃度為1mg/ml,實(shí)驗(yàn)組中ant濃度為10-5mg/ml,混勻后將溶液靜置于4℃條件下放置30min。采用ftir中的衰減全反射(attenuatedtotalreflection,atr)光譜技術(shù)測(cè)量,測(cè)量波數(shù)范圍為4000-600cm-1。點(diǎn)樣前用酒精棉擦拭載物臺(tái),待酒精揮發(fā)后再滴加待分析物進(jìn)行測(cè)試。偶聯(lián)后的樣品稀釋后可用于下述elisa方法建立。
實(shí)施例2
一、間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以及檢出限
向96孔酶標(biāo)板中每孔加入100μl稀釋2000倍的包被抗原,于4℃條件下包被過(guò)夜12h。倒出孔內(nèi)液體,用洗滌液pbs-t振蕩洗滌3min,重復(fù)3次,拍干待用;每孔加封閉液膠200μl,于37℃封閉60min,倒出孔內(nèi)液體,重復(fù)上述洗滌步驟,拍干待用;將一抗稀釋至0.275μg·ml-1,每孔加入50μl,將ant用10%體積的丙酮溶液稀釋配制為10、20、50、100、200、500、1000、10000ng/ml系列濃度,每孔加入50μl,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,于37℃溫育60min。重復(fù)上述洗滌步驟,拍干待用;將酶標(biāo)二抗用稀釋至0.1μg·ml-1,每孔加入100μl,于37℃溫育60min,重復(fù)上述洗滌步驟,拍干待用;每孔加入tmb底物溶液100μl,室溫下顯色15min;每孔加入50μl終止液終止反應(yīng);采用酶標(biāo)儀于450nm及630nm處測(cè)定od值。以ant濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;求半抑制濃度ic50;對(duì)最低濃度10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定11次,11個(gè)樣品的結(jié)果計(jì)算檢出限和檢出下限。
ic50為抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的pahs的濃度;
抑制率(%)=(1-b/b0)×100%;(b=od450-od630,b0為空白)
計(jì)算求得蒽的半抑制濃度為185.95ng/ml,檢出限為2.43ng/ml。
二、交叉反應(yīng)率測(cè)定
將ant換成萘(naphthalene,nap)、菲(phenanthrene,phe)和熒蒽(fluoranthene,flu),按照上述步驟,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分別求得其半抑制濃度ic50。按如下公式計(jì)算ant與上述多環(huán)芳烴的交叉反應(yīng)率(crossreaction,cr%)及抑制率。
cr(%)=(ic50ant/ic50otherpahs)×100%
計(jì)算求得萘的半抑制濃度為3262.28ng/ml,交叉反應(yīng)率為5.7%;菲的半抑制濃度為973.56ng/ml,交叉反應(yīng)率為19.1%;熒蒽的半抑制濃度大于2×105ng/ml,交叉反應(yīng)率小于0.1%。
三、精密度測(cè)試
將ant用丙酮溶液稀釋濃度為0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的溶液,按上述建立的間接elisa法操作步驟,在相同條件下測(cè)定同一濃度在同一板內(nèi)、不同時(shí)間的od值,重復(fù)5次,計(jì)算其板內(nèi)變異系數(shù)(coefficientofvariation,cv),即板內(nèi)精密度。
將ant用丙酮溶液稀釋濃度為0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的溶液,按上述建立的間接elisa法操作步驟,在相同條件下測(cè)定同一濃度在不同板內(nèi)、相同時(shí)間的od值,重復(fù)5次,計(jì)算其板間變異系數(shù)(coefficientofvariation,cv),即板間精密度。
變異系數(shù)(cv)=(標(biāo)準(zhǔn)偏差sd/平均值mean)×100%
表2.1ic-elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線孔間差異(板內(nèi))
表2.2ic-elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線孔間差異(板間)
由表2.1和2.2可知,od值變異系數(shù)(cv)均小于10%,說(shuō)明本測(cè)定方法的差異較小,具有良好的重復(fù)性。
四、加標(biāo)回收率測(cè)定
提取自來(lái)水、湖水及河水作為樣品,根據(jù)上述建立的間接競(jìng)爭(zhēng)elisa方法的線性檢測(cè)范圍,以及水樣中的蒽含量,選擇20、50和100ng/ml作為加標(biāo)濃度,采用ic-elisa分別對(duì)加標(biāo)前后的樣品進(jìn)行測(cè)定分析,每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次,取平均值,最后用以下公式計(jì)算該方法的加標(biāo)回收率。
回收率(%)=(加標(biāo)后測(cè)定值-加標(biāo)前測(cè)定值)/已知加標(biāo)量×100%。
表2.3間接競(jìng)爭(zhēng)elisa加標(biāo)回收率
蒽的標(biāo)準(zhǔn)添加回收率范圍為89.15%~113.57%,計(jì)算的回收率結(jié)果較為滿意,方法的準(zhǔn)確度符合分析的要求。