本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用特定尺寸熒光微球、特定尺寸大微球、抗體——微球偶聯(lián)技術(shù)、塑料基材綜合應(yīng)用的定量測定方法及其裝置，更具體的涉及一種用于檢測分析物在樣品中是否存在及其含量的測定方法。

背景技術(shù)：

基于膜的側(cè)向流動(dòng)免疫測定已被商品化，用于對(duì)大量分析物的測定。基于該技術(shù)平臺(tái)的醫(yī)療診斷產(chǎn)品，包括妊娠測試，藥物濫用測試、某些疾病的標(biāo)志物等。大多數(shù)使用該平臺(tái)的現(xiàn)有商品可提供定性和半定量結(jié)果。但是該技術(shù)無法避免地需要使用硝酸纖維素膜這種基本材料，并把抗體(或抗原)固定到膜上，提供信號(hào)的微球(或染料)偶聯(lián)了抗體并結(jié)合檢測物在膜上做側(cè)向擴(kuò)撒運(yùn)動(dòng)。但是，硝酸纖維素膜本身的cv就超過8％，導(dǎo)致該技術(shù)產(chǎn)品檢測的cv值居高不下，特別是臨床上某些項(xiàng)目，例如crp、pct等，很難達(dá)到精確檢測的要求，其結(jié)果與化學(xué)發(fā)光比較相去甚遠(yuǎn)。為了解決硝酸纖維素膜本身cv大的問題，人們想到了微流控技術(shù)。該技術(shù)是在聚合物，例如聚二甲基硅氧烷，上刻微米尺寸的孔道，并在上面集成閥、泵等微器件，其成本之高，已經(jīng)超出了市場可接受的范圍。而且，微流控技術(shù)還有一些問題亟待解決，例如微液滴的混勻問題等。

本方法放棄了硝酸纖維素的使用，用成本低廉的聚合物微球包被抗體(或抗原)替代傳統(tǒng)側(cè)向流層析中的檢測線和控制線，避免了由于硝酸纖維素膜本身的高cv帶來的檢測結(jié)果的高cv。此外，本方法所使用的結(jié)合物基材是使用壓模工藝制備，其成本之低，又是傳統(tǒng)意義上的微流控?zé)o法比擬的，順利解決了微流控高成本的問題。整個(gè)反應(yīng)過程是在液體均相中進(jìn)行，也大大降低了cv、提高了檢測的靈敏度。因此，本方法避免了硝酸纖維素膜為基礎(chǔ)的側(cè)向流層析的高cv缺陷，還避免了傳統(tǒng)微流控技術(shù)高成本短板，兼具了低cv、低成本、高靈敏度等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了傳統(tǒng)側(cè)向流層析cv較大的缺點(diǎn)，本發(fā)明提出了一種基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控檢測技術(shù)，使用它可以對(duì)樣本中的特定分子進(jìn)行定性/定量檢測，且cv較低，滿足臨床檢測的要求。

附圖說明

圖1是一種基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控檢測技術(shù)所使用的芯片基片結(jié)構(gòu)示意圖。該圖展示了樣品槽、偶聯(lián)抗體的熒光粒子、檢測槽和吸水槽的位置。

圖2是一種基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控檢測技術(shù)的外觀圖。該圖展示了基片加蓋后的整體外觀。

圖3是根據(jù)實(shí)施例1中的crp單重檢測數(shù)據(jù)所描繪出來的“熒光——濃度”曲線圖，反映了不同的crp校準(zhǔn)品濃度下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度關(guān)系。

圖4是根據(jù)實(shí)施例2中的三重檢測crp數(shù)據(jù)所描繪出來的“熒光——濃度”曲線圖，反映了不同的crp校準(zhǔn)品濃度下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度關(guān)系。

圖5是根據(jù)實(shí)施例2中的三重檢測pct數(shù)據(jù)所描繪出來的“熒光——濃度”曲線圖，反映了不同的pct校準(zhǔn)品濃度下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度關(guān)系。

圖6是根據(jù)實(shí)施例2中的三重檢測d-dimer數(shù)據(jù)所描繪出來的“熒光——濃度”曲線圖，反映了不同的d-dimer校準(zhǔn)品濃度下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度關(guān)系。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

工程塑料基材：

以工程塑料為材料、通過注塑或壓膜加工成型的基材，所述基材有添加樣品區(qū)域，即樣品槽；有熒光微球放置區(qū)域；有檢測區(qū)域，即檢測槽；有吸水區(qū)域，即吸水槽。沿所述液體流動(dòng)方向還設(shè)置有檢測槽與控制槽的物理性分離區(qū)域?；牡捉?jīng)親水處理。

熒光微球放置區(qū)域，沉積有“熒光微球——一抗”結(jié)合物探針，其中所述結(jié)合物探針具有與被檢測物形成特異蛋白結(jié)合的特點(diǎn)。

檢測槽區(qū)域，放置有白色微球；其中所述白色微球表面偶聯(lián)二抗(雙抗體夾心法)，或所述白色微球表面偶聯(lián)檢測物(競爭法)。

吸水槽區(qū)域，放置有吸水性材料。

整個(gè)基材結(jié)構(gòu)為壓片結(jié)構(gòu)，即基材底加基材蓋?；纳w為弧形凸面結(jié)構(gòu)，使流道密封性完好。

固定相微球：

固定相微球微球，其微球的粒徑范圍為100～1000μm不等。

其材質(zhì)為苯乙烯、乙烯基甲苯、甲基丙烯酸甲酯、羥乙基丙烯酸甲酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯、丙烯醛、氯甲基苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯等材質(zhì)的聚合物或共聚物。

其表面基團(tuán)為氨基、羧基、醛基、磺酸基、硫酸基、環(huán)氧基、氯甲基、鏈霉親和素不等。

其內(nèi)部可封裝不同的量的彩色染料、熒光、時(shí)間分辨熒光、或量子點(diǎn)等材料。

檢測相微球：

檢測相微球微球，其微球的粒徑范圍為50～1000nm不等。

其材質(zhì)為苯乙烯、乙烯基甲苯、甲基丙烯酸甲酯、羥乙基丙烯酸甲酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯、丙烯醛、氯甲基苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯等材質(zhì)的聚合物或共聚物。

其表面基團(tuán)為氨基、羧基、醛基、磺酸基、硫酸基、環(huán)氧基、氯甲基、鏈霉親和素不等。

其封裝的熒光物質(zhì)為彩色染料、熒光、時(shí)間分辨熒光、或量子點(diǎn)等材料。

實(shí)施例1：crp單重檢測

微球微流控測定裝置，其樣品槽深度范圍為500μm，檢測槽深度范圍為500μm，控制槽深度范圍為500μm，吸水槽深度范圍為500μm。

固定相微球粒徑為450μm，便于物理固定在檢測槽內(nèi)，選取灰度值為3000左右的微球，表面包被“抗-crp第一抗體”，制成“固定相微球-抗-crp第一抗體”復(fù)合物，與其它灰度固定相微球混合，滴加在檢測槽內(nèi)。

檢測相微球粒徑為200nm，選取488nm激發(fā)、535nm發(fā)射的熒光染料封裝在微球內(nèi)部。然后在微球表面包被“抗-crp第二抗體”，制成“檢測相微球-抗-crp第二抗體”復(fù)合物，固定在檢測槽上游的通道上。

分別使用0.5μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml的校準(zhǔn)品5μl和45μl緩沖液混合，得50μl液，滴加在樣品槽中，5min后用100μl緩沖液滴加在樣品槽中沖洗后讀數(shù)。選取灰度為3000左右的固定相區(qū)域，讀取熒光值，其結(jié)果如下。

實(shí)施例2：crp、pct、d-dimer三重檢測

微球微流控測定裝置，其樣品槽深度范圍為500μm，檢測槽深度范圍為500μm，控制槽深度范圍為500μm，吸水槽深度范圍為500μm。

固定相微球粒徑為450μm，便于物理固定在檢測槽內(nèi)。

選取灰度值為3000左右的微球，表面包被“抗-crp第一抗體”，制成“固定相微球-抗-crp第一抗體”復(fù)合物；選取灰度值為5700左右的微球，表面包被“抗-pct第一抗體”，制成“固定相微球-抗-pct第一抗體”復(fù)合物；選取灰度值為8900左右的微球，表面包被“抗-d-dimar第一抗體”，制成“固定相微球-抗-d-dimer第一抗體”復(fù)合物。

將3種固定相微球混合，滴加在檢測槽內(nèi)。

檢測相微球粒徑為200nm，選取488nm激發(fā)、535nm發(fā)射的熒光染料封裝在微球內(nèi)部。在微球表面包被“抗-crp第二抗體”，制成“檢測相微球-抗-crp第二抗體”復(fù)合物；在微球表面包被“抗-pct第二抗體”，制成“檢測相微球-抗-pct第二抗體”復(fù)合物；在微球表面包被“抗-d-dimer第二抗體”，制成“檢測相微球-抗-d-dimer第二抗體”復(fù)合物。將3種檢測相微球復(fù)合物混合，固定在檢測槽上游的通道上。

分別使用0.5μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml的crp校準(zhǔn)品5μl和45μl緩沖液混合，得50μl液，滴加在樣品槽中，5min后用100μl緩沖液滴加在樣品槽中沖洗后讀數(shù)。選取灰度為3000左右的固定相區(qū)域，讀取熒光值。

分別使用0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、50ng/ml的pct校準(zhǔn)品5μl和45μl緩沖液混合，得50μl液，滴加在樣品槽中，5min后用100μl緩沖液滴加在樣品槽中沖洗后讀數(shù)。選取灰度為5700左右的固定相區(qū)域，讀取熒光值。

分別使用1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、60mg/ml的d-dimer校準(zhǔn)品5μl和45μl緩沖液混合，得50μl液，滴加在樣品槽中，5min后用100μl緩沖液滴加在樣品槽中沖洗后讀數(shù)。選取灰度為8900左右的固定相區(qū)域，讀取熒光值。

其結(jié)果如下：

crp

pct

d-dimer