本申請(qǐng)涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞即為起源細(xì)胞。干細(xì)胞是具有增殖和分化潛能的細(xì)胞，具有自我更新復(fù)制的能力(Self-renewing)，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞。簡(jiǎn)單來(lái)講，它是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始的未分化細(xì)胞，是形成哺乳類動(dòng)物的各組織器官的原始細(xì)胞。干細(xì)胞在形態(tài)上具有共性，通常呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體積小，核相對(duì)較大，細(xì)胞核多為常染色質(zhì)，并具有較高的端粒酶活性。干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化功能細(xì)胞，主要由于細(xì)胞本身的狀態(tài)和微環(huán)境因素所決定。包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的各種周期素(Cyclin)和周期素依賴激酶(Cyclin－DependentKinase)、基因轉(zhuǎn)錄因子、影響細(xì)胞不對(duì)稱分裂的細(xì)胞質(zhì)因子。微環(huán)境因素，包括干細(xì)胞與周圍細(xì)胞，干細(xì)胞與外基質(zhì)以及干細(xì)胞與各種可溶性因子的相互作用。人體內(nèi)的干細(xì)胞分兩種類型，一種是全功能干細(xì)胞，可直接克隆人體；另一種是多功能干細(xì)胞，可直接復(fù)制各種臟器和修復(fù)組織。人類寄希望于利用干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，在體外繁育出組織或器官，并最終通過(guò)組織或器官移植，實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床疾病的治療。最新的研究表明，組織特異性干細(xì)胞同樣具有分化成其他細(xì)胞或組織的潛能，這為干細(xì)胞的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了更廣泛的空間。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC,mesenchymalstemcells)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSC最初在臍血中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。臍血是臍帶及胎盤(pán)近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其主要包含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。臍血來(lái)源充足，采集方便，免疫原性較弱，能更大程度上耐受HLA配型不符，其間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始，擴(kuò)增能力較臍血間充質(zhì)干細(xì)胞更強(qiáng)，故臍血干細(xì)胞的作用越來(lái)越突出，可用于各系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療和作為基因治療的載體。臍血來(lái)源的造血干細(xì)胞已經(jīng)用于治療血液系統(tǒng)疾病，如白血病患者造血系統(tǒng)重建，但是臍血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值始終沒(méi)有被挖掘。在使用過(guò)程中，如何有效的分離臍血間充質(zhì)干細(xì)胞也是一個(gè)難點(diǎn)。因此，如何有效的分離臍血間充質(zhì)干細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員面對(duì)的一個(gè)難題。CN1878860A中公開(kāi)了一種分離和培養(yǎng)來(lái)自臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：在體積為大于45ml/單位的臍帶血中添加抗凝劑，所述臍帶血是在分娩后對(duì)小時(shí)內(nèi)獲得的純臍帶血；以α-極限必需培養(yǎng)基(αMEM)稀釋所得的抗凝劑和臍帶血的混合物，隨后離心收集單核細(xì)胞；以及將獲得的單核細(xì)胞在αMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中加入干細(xì)胞因子、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、IL_3(白細(xì)胞介素-3)和IL-6(白細(xì)胞介素_6)。由于該方法分離步驟復(fù)雜，操作較為困難，因此，并不適宜廣泛的推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種用于快速鑒定人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，以及相應(yīng)的鑒定用的適配子。按照CN1878860A中公開(kāi)的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，獲得相應(yīng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，作為研究對(duì)象。本發(fā)明的目的是提供一種人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的核酸適配體序列。本發(fā)明中，所述的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的核酸適配體(序列1-5)能夠特異結(jié)合人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序列應(yīng)用，可進(jìn)一步用于制備特異性分離人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。中篩選出與人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞特異結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物F(5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’)和R(5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’)進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19-T載體(購(gòu)自上海生工生物公司)，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自上海生工生物公司)；挑去白色菌落進(jìn)行PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒并測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序。本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術(shù)，以人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞為正篩靶標(biāo)，以人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和人肌肉來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為反篩靶標(biāo)，篩選與人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的序列，本發(fā)明中命名為適配體CBMSC-1～5。序列如下：本發(fā)明的適配子可以用于構(gòu)建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離人成熟的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，所述方法比采用CN1878860A分離的方法具有分離成本低，時(shí)間更加簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本公開(kāi)的適配子分子可用作將靶標(biāo)結(jié)合或固定至固相載體的捕獲試劑。固相載體可以由具有通常與過(guò)濾器、晶片、晶圓芯片、膜和薄膜有關(guān)的結(jié)構(gòu)和組成的基底組成。然而，預(yù)期固相載體可由這樣的基底組成，其包括但不限于樹(shù)脂、親和樹(shù)脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕獲或固定用于診斷、檢測(cè)或定量研宄的試劑的診斷性檢測(cè)試劑。固相載體可以基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金屬表面，以及諸如鋼材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的組合。本發(fā)明的有益效果：通過(guò)制備特異性的結(jié)合人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的適配體以及相應(yīng)的試劑盒可以用于實(shí)現(xiàn)特異性分離純化人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，所述方法制備簡(jiǎn)單，成本低廉，可以用于批量制備所述的試劑盒。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成熟細(xì)胞的制備按照CN1878860A中公開(kāi)的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，獲得相應(yīng)的的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，所述細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá):CD29，CD44，而陰性表達(dá):CD34、CD45、CD14。實(shí)施例2核酸適配體篩選從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。富集所用引物:F：5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’R：5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’將寡聚DNA文庫(kù)測(cè)定OD260后，離心干燥；用300ul結(jié)合緩沖液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgCl2,2mg/mLBSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文庫(kù),取250pmol(第一輪10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速離心。反篩:將250pmol的文庫(kù)吸入含有人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的直徑6cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為2.0×106個(gè)/ml。用結(jié)合緩沖液補(bǔ)足到1mL；4℃搖床振蕩3h；取上清液。正篩:將反篩上清液加入到含有實(shí)施例1制備的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為2.0×106個(gè)/ml，4℃搖床振蕩1h；棄上清液；用洗滌緩沖液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgC12)洗滌人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞三遍；用1mL洗滌緩沖液將人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待變冷后，10000rpm離心5min；上清轉(zhuǎn)移到一干凈的EP管中。富集:配置PCR體系(總體積1000ul):H20740ul，10XPCR緩沖液100ul，dNTP80ul，引物混合物25ul(F:100uM，100uM),DNA模板(正篩上清)50ul，TaqHS酶5ul。按如下條件在PCR儀上擴(kuò)增:94℃加熱預(yù)變性2min后，94℃變性30s，58℃退火20s，72。。延伸20s,20個(gè)循環(huán)，72℃延伸4min，4℃保溫<lh。純化:純化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗兩遍，加入150ulGE的StreptavidinSepharose后PBS洗兩遍,加入PCR產(chǎn)物,搖床振蕩20min,放出液體,PBS洗兩遍后,加0.5mLNaOH靜置2-3min后放出液體，放出液上脫鹽柱，待液體從脫鹽柱幾乎流盡時(shí)加1mLMilliQ水洗脫，同時(shí)開(kāi)始接洗脫液lmL，該洗脫液即為富集了的寡聚DNA文庫(kù)。將富集了的寡聚DNA文庫(kù)進(jìn)行常規(guī)的TA克隆，而后進(jìn)行菌落PCR與測(cè)序。測(cè)序結(jié)果為SEQIDNO：1-5所示。實(shí)施例3適配子結(jié)合特性驗(yàn)證取人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分別與不同濃度0、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM)的適配子CBMSC-(1～5)孵育20min，洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著適配子濃度的增加，其對(duì)靶細(xì)胞的結(jié)合力就越強(qiáng)，最終結(jié)合趨于飽和。當(dāng)適配子與細(xì)胞結(jié)合率達(dá)到50％時(shí)，此時(shí)所需的適配子的濃度就是其平衡解離常數(shù)Kd，由此我們可以得到適配子各自與細(xì)胞的結(jié)合力常數(shù)分別如下：適配子名稱解離常數(shù)Kd(nM)CBMSC-18.9CBMSC-217.6CBMSC-322.5CBMSC-419.6CBMSC-527.4實(shí)施例4所述適配子特異性分析將50nM的FITC標(biāo)記的適配子CBMSC-1～5分別與成熟的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、人肌肉來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、紅細(xì)胞結(jié)合20min，洗滌，4％的多聚甲醛固定后進(jìn)行共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，適配子CBMSC-1～5均能很好的與其結(jié)合，且在細(xì)胞膜上可以看到很明顯的熒光，而對(duì)于人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、人肌肉來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)，適配子CBMSC-1～5均沒(méi)有明顯地與其結(jié)合，所以在熒光場(chǎng)中基本看不到熒光。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論:本發(fā)明的適配子序列均能很好的與靶細(xì)胞結(jié)合，而且靶向性也很好。實(shí)施例5分析細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明的適配子分別偶聯(lián)磁珠，將培養(yǎng)的成熟人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞到無(wú)菌離心管中，取1mL細(xì)胞懸浮液經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)其中的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞個(gè)數(shù)，其數(shù)量為4.9X105。分別將偶聯(lián)有磁珠的適配子與等量的細(xì)胞懸浮液(每mL中加入1000個(gè)人紅細(xì)胞)混合孵育20分鐘，而后磁分離，即可獲得相應(yīng)的分離的細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)剩余的細(xì)胞個(gè)數(shù)，按照(4.9X105-剩余的個(gè)數(shù))/4.9X105*100％得到了相應(yīng)的分離效率如下。適配子名稱分離效率(100％)CBMSC-199.7CBMSC-298.8CBMSC-399.5CBMSC-499.2CBMSC-599.0對(duì)照未偶聯(lián)適配子的對(duì)照0.13分別將每一個(gè)分離得到的成熟人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀以及電鏡分析，發(fā)現(xiàn)所述的細(xì)胞均為人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。這說(shuō)明，本發(fā)明的適配子可以用于很好的分離人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例6成像效果檢測(cè)按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法將已經(jīng)標(biāo)記有磁珠的適配子CBMSC-1與疊氮-熒光量子點(diǎn)復(fù)合物相室溫孵育偶聯(lián)2h，形成相應(yīng)的復(fù)合物。其中疊氮-熒光量子點(diǎn)復(fù)合物的量為細(xì)胞摩爾量的20倍。而后，將所述偶聯(lián)物與混合有人成熟骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、人肌肉來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和紅細(xì)胞的細(xì)胞混合液混合1h，進(jìn)行熒光成像，通過(guò)成像發(fā)現(xiàn)，所述的人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分布比較均勻。通過(guò)磁性分離，采用細(xì)胞標(biāo)志物鑒定發(fā)現(xiàn)，所述的細(xì)胞均為人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。采用適配子CBMSC-2～5也采用上述的成像效果檢測(cè)，通過(guò)成像發(fā)現(xiàn)，其效果與適配子CBMSC-1的效果一致。實(shí)施例7分離的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化研究步驟1:將實(shí)施例5分離得到的人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在真皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)體系，即含高糖DMEM培養(yǎng)基，5％胎牛血清，15ng/mL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，胰島素鐵硒傳遞蛋白，0.1Mmol/L地塞米松，100U/mL青霉素和IOOPg/mL鏈霉素的真皮誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基作用下誘導(dǎo)分化為成纖維細(xì)胞；在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10μg/mL胰島素，/mL維甲酸，/ml氯化鈣進(jìn)行誘導(dǎo)，使其分化為表皮干細(xì)胞，其中所述的完全培養(yǎng)基為L(zhǎng)G-DMEM含10％的小牛血清、100U/mL青霉素和100μδ/mL鏈霉素；通過(guò)向經(jīng)47℃熱休克處理的汗腺細(xì)胞中，加入約(1-2)XlO5BrdU標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)5天，使其誘導(dǎo)分化為汗腺細(xì)胞。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙染法檢測(cè)共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分離的人成熟臍血間充質(zhì)干細(xì)胞能夠很好的誘導(dǎo)形成相應(yīng)的表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞，可以作為皮膚組織工程種子細(xì)胞。這說(shuō)明本發(fā)明分離得到臍血間充質(zhì)干細(xì)胞具有相應(yīng)的活性，可以使用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉魏乃東〈120〉一種分離人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉CBMSC-1TGGACAGACGTAAGACGTAACCTCATTACATTCCCTTGTATCAAACAACACTTCATTGAGATGCCAGTAGTGACGA〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉CBMSC-2TGGACAGACGTAAGACGTAAACCCTTCCTCCCCAAACAAACTTTGTTTACCCTTCATGAGATGCCAGTAGTGACGA〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉CBMSC-3TGGACAGACGTAAGACGTAAAATAAATCTCTTCTATGTCTTACAACTCCCATACTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉CBMSC-4TGGACAGACGTAAGACGTAAAAATCCTCTCCAGACACTTACTCCCAACCTCACTATTGAGATGCCAGTAGTGACGA〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉CBMSC-5TGGACAGACGTAAGACGTAACTACACCAATCACACAGACTTAATCCACCACATAAATGAGATGCCAGTAGTGACGA當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3