本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種微電極生物傳感器及其在植物水楊酸在線檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水楊酸(salicylicacid，SA)是植物組織內(nèi)廣泛存在的天然活性小分子酚類物質(zhì)，具有重要的藥理效應(yīng)，參與植物的生長發(fā)育以及參與植物的抗逆性、抗病性等生理過程，對植物生理代謝具有調(diào)控作用，比如可調(diào)控果實(shí)的衰老。目前檢測水楊酸的方法包括：紫外分光光度法、離子色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法，上述方法選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對材料取樣，經(jīng)過復(fù)雜處理過程，最終通過儀器分析水楊酸在植物體中某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的含量，采用離體取樣的方式，對樣本材料構(gòu)成破壞，尤其珍貴材料可能造成徹底破壞；此外現(xiàn)有檢測植物體水楊酸含量技術(shù)不能實(shí)現(xiàn)在體連續(xù)實(shí)時(shí)檢測，只能通過提前設(shè)定好時(shí)間間隔離體取樣，這樣檢測結(jié)果不具有時(shí)間連續(xù)性，無法反映植物體內(nèi)水楊酸動(dòng)態(tài)含量變化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新型的微電極生物傳感器及其在植物水楊酸在線檢測中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的微電極生物傳感器，所述微電極長4-8cm，其尖端部分長5-30mm，寬度2mm，厚度0.5mm；所述微電極的基底電極材料為硅片，所述微電極具有三電極體系，包含Ag/AgCl參比電極，鉑對電極以及由碳納米管材料修飾的金工作電極，三個(gè)電極裸露導(dǎo)電部分長×寬均為0.5mm×0.5mm(圖1)。所述硅片基底1的尖端上順次設(shè)置有金工作電極2、Ag/AgCl參比電極3、鉑對電極4；硅片基底的另一端較寬，其上設(shè)置有三根導(dǎo)線5，分別與上述三個(gè)電極相連，導(dǎo)線的另一端用于連接電化學(xué)工作站。所述微電極生物傳感器可按如下方法制備得到：1)采用濺射技術(shù)和蝕刻技術(shù)在硅片基底上制備鉑對電極、Ag/AgCl參比電極以及金工作電極；2)配制碳納米管材料溶液：將碳納米管(直徑4-5nm、長度0.5-1.5μm)1mg溶解于10mL下述混合液中，取5-10μL滴涂在金工作電極表面，晾干后在pH6.86的0.05mol/L磷酸緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10-15次，在1.3V恒定電位下電解10-15分鐘，即得探針狀的微電極生物傳感器。所述混合液配方為：0.05mol/L吡咯、0.01mol/L水楊酸、0.1mol/LKCl。制備的微電極生物傳感器呈針形探針狀，目的是可以突破植物表皮插入組織內(nèi)部。本發(fā)明還提供所述微電極生物傳感器在植物水楊酸在線檢測中的應(yīng)用。將所述微電極生物傳感器插入待測植物組織中，連接電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，實(shí)現(xiàn)對植物組織進(jìn)行在線水楊酸檢測。檢測前選取不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行微電極檢測，根據(jù)水楊酸濃度與電流關(guān)系獲得微電極檢測水楊酸工作曲線；所述微電極最低檢測限為8.0×10-6mol/L，線性范圍為2.0×10-5-1.2×10-3mol/L，水楊酸溶液濃度與響應(yīng)峰電流的線性方程為：I＝9×10-4C+11.40，相關(guān)性系數(shù)為0.93；其中，I表示電流，單位為μA，C表示濃度，單位為mol/L。檢測對象包括植物的根、莖、葉或果實(shí)等部位，插入深度為0.5cm左右。檢測目標(biāo)材料是植物生長的不同時(shí)期，例如圣女果成熟期的果實(shí)。優(yōu)選地，在0.9V工作電位下，采用計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行植物組織內(nèi)水楊酸的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測。而在其他電位下檢測，系統(tǒng)噪音大、信號不準(zhǔn)確，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。從電流平穩(wěn)后開始計(jì)時(shí)，采集第10分鐘的電流數(shù)據(jù)代入線性方程，得到植物組織中水楊酸的濃度。本發(fā)明通過活體在線監(jiān)測植物體水楊酸含量，真實(shí)記錄和實(shí)時(shí)分析水楊酸含量變化情況，將微電極生物傳感器刺入植物組織內(nèi)部，采用微創(chuàng)方式，不會(huì)對植物造成實(shí)質(zhì)性的損傷或破壞，植物還可以正常生長，該檢測方法可靠，測定結(jié)果準(zhǔn)確，為植物水楊酸檢測提供新的方法，豐富植物抗逆、抗病研究中水楊酸檢測手段。附圖說明圖1為本發(fā)明微電極生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1-硅片基底，2-金工作電極，3-Ag/AgCl參比電極，4-鉑對電極，5-導(dǎo)線。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1微電極生物傳感器及其制備方法本實(shí)施例中制備的微電極生物傳感器，5-30mm，寬度2mm，厚度0.5mm；所述微電極的基底電極材料為硅片，所述微電極具有三電極體系，包含Ag/AgCl參比電極，鉑對電極以及由碳納米管材料修飾的金工作電極，三個(gè)電極裸露導(dǎo)電部分長×寬均為0.5mm×0.5mm(圖1)。所述硅片基底1的尖端上順次設(shè)置有金工作電極2、Ag/AgCl參比電極3、鉑對電極4；硅片基底的另一端較寬，其上設(shè)置有三根導(dǎo)線5，分別與上述三個(gè)電極相連，導(dǎo)線的另一端用于連接電化學(xué)工作站。制備的微電極生物傳感器呈針形探針狀，目的是可以突破植物表皮插入組織內(nèi)部。所述微電極生物傳感器可按如下方法制備得到：1)采用濺射技術(shù)和蝕刻技術(shù)在硅片基底上制備鉑對電極、Ag/AgCl參比電極以及金工作電極；2)配制碳納米管材料溶液：將直徑4-5nm、長度0.5-1.5μm的碳納米管1mg溶解于10mL下述混合液中，取5-10μL滴涂在金工作電極表面，晾干后在pH6.86的0.05mol/L磷酸緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10-15次，在1.3V恒定電位下電解10-15分鐘，即得探針狀的微電極生物傳感器。步驟2)所述混合液配方為：0.05mol/L吡咯、0.01mol/L水楊酸、0.1mol/LKCl。實(shí)施例2利用微電極生物傳感器對植物水楊酸進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測1、實(shí)驗(yàn)對象實(shí)驗(yàn)材料選擇盆栽已經(jīng)成熟的圣女果秧苗，以圣女果秧苗上的成熟期果實(shí)為檢測對象，檢測時(shí)間是上午十點(diǎn)，在圣女果果實(shí)上隨機(jī)不同部位插探針，檢測水楊酸含量。2、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材實(shí)驗(yàn)儀器采用電化學(xué)工作站CHI760E，購自上海辰華儀器有限公司，型號CHI76E。3、實(shí)驗(yàn)方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將實(shí)施例1制備的微電極生物傳感器連接電化學(xué)工作站CHI760E，選取不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行微電極檢測，工作電位為0.9V，從電流平穩(wěn)后開始計(jì)時(shí)，采集第10分鐘開始的的電流數(shù)據(jù)；根據(jù)水楊酸濃度與電流關(guān)系獲得微電極檢測水楊酸工作曲線。通過循環(huán)伏安法確定用于在線檢測水楊酸探針檢測濃度范圍是2.0×10-5-1.2×10-3mol/L，在此濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，關(guān)系式為：I(μA)＝9×10-4C(mol/L)+11.40(相關(guān)系數(shù)0.93，n＝6)，檢出限為8.0×10-6mol/L。(2)實(shí)驗(yàn)步驟：a.測試前準(zhǔn)備盆栽成熟期圣女果秧苗；b.將制備好的探針插入待測圣女果果實(shí)中，插入果實(shí)的果柄基部、果實(shí)側(cè)面、果實(shí)底部，深度為0.5cm，用于檢測圣女果果實(shí)不同部位的水楊酸含量；c.將三個(gè)同樣探針連接到電化學(xué)工作站CHI760E；d.通過循環(huán)伏安法監(jiān)測水楊酸在碳納米管上與吡咯發(fā)生氧化還原反應(yīng)，確定工作電位為0.9V；e.在0.9V工作電位下，采用計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行圣女果內(nèi)水楊酸的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測；f.從電流平穩(wěn)后開始計(jì)時(shí)，采集第10分鐘開始的數(shù)據(jù)(第10分鐘之前的數(shù)據(jù)因系統(tǒng)和環(huán)境干擾信號不準(zhǔn)確)，的電流數(shù)據(jù)代入線性方程，得到圣女果果實(shí)中水楊酸的濃度。4、實(shí)驗(yàn)評價(jià)結(jié)果利用上海辰華電化學(xué)工作站CHI760E及實(shí)施例1制備的微電極生物傳感器，在線檢測分析圣女果果實(shí)水楊酸含量結(jié)果顯示：果柄基部：3.1×10-4mol/L果實(shí)側(cè)面：6.2×10-3mol/L果實(shí)底部：2.1×10-3mol/L檢測數(shù)據(jù)較好，檢測結(jié)果可靠，通過電化學(xué)工作站可以實(shí)現(xiàn)水楊酸在線動(dòng)態(tài)檢測分析，為活體在線研究植物水楊酸含量提供了新方法，實(shí)現(xiàn)對現(xiàn)有靜態(tài)檢測手段的補(bǔ)充。5、微電極生物傳感器檢測結(jié)果準(zhǔn)確性分析為了驗(yàn)證微電極生物傳感器檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)氣相色譜法檢測水楊酸含量進(jìn)行了比較。(1)提?。喝∩鲜鱿嗤氖ヅ麑?shí)作為檢測對象，分別切取圣女果果實(shí)果柄基部、果實(shí)側(cè)面、果實(shí)底部材料各0.5g，液氮研磨后用1ml丙酮和50ml檸檬酸提取液提取水楊酸，然后加入1ml乙酸乙酯(純度99％)，離心取上清，氮?dú)飧稍锖笏脴悠穫溆谩?2)甲酯化：將100μl乙醚/甲醇(體積比9:1)和4μl2mM三甲基硅烷化重氮甲烷加入到進(jìn)樣瓶中，室溫放置30min，將吸附管一端深至進(jìn)樣瓶中，另一端連接抽氣瓶，進(jìn)樣瓶需水浴收集樣品，吸附管冷卻后用300μl正己烷洗脫，保存-20℃冰箱備用。(3)吸附劑再生：向吸附管中加入300μl甲醇后，再用300μl正己烷洗2-3次，干燥備用。(4)水楊酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的配制：配制正己烷(純度＞99％)溶解的1000μg/ml水楊酸甲酯(Sigma)標(biāo)準(zhǔn)溶液(母液)，稀釋后得到400μg/ml水楊酸甲酯溶液，稀釋成一系列濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(5)標(biāo)準(zhǔn)品甲酯化：取160μg/ml水楊酸存儲液125μl，按照上述甲酯化過程，最后用100μl正己烷洗脫，得到200μg/ml水楊酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，保存-20℃冰箱備用。(6)氣相色譜：采用HP-5石英毛細(xì)管分離樣品，溫度從60℃保持1min開始，間隔15℃/分鐘到250℃，保持3min，進(jìn)樣口溫度280℃，檢測器溫度300℃。采用氮?dú)庾鳛檩d氣，載氣流量1ml/min，F(xiàn)ID火焰離子檢測器檢測，進(jìn)樣量1μl。水楊酸回收率：取0ng、100ng、200ng、400ng水楊酸甲酯，重復(fù)樣品提取和甲酯化步驟，用正己烷洗脫后氣相色譜測定含量。檢測圣女果果實(shí)樣品溶液中水楊酸含量見表1。表1氣相色譜測定水楊酸含量結(jié)果(單位：mol/L)內(nèi)容果柄基部mol/L果實(shí)側(cè)面果實(shí)底部mol/L果實(shí)12.9×10-46.1×10-32.02×10-3果實(shí)23.4×10-45.96×10-32.13×10-3果實(shí)33.7×10-46.31×10-31.96×10-3可見，利用傳統(tǒng)的氣相法色譜檢測結(jié)果與本發(fā)明的微電極生物傳感器檢測結(jié)果基本一致，從而證明本方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3