本發(fā)明涉及生物傳感器領(lǐng)域，尤其涉及磁性復(fù)合納米材料、電化學(xué)生物傳感器及制備、構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

電化學(xué)傳感器是一項(xiàng)新型分析測(cè)試技術(shù)，具有選擇性好，靈敏度高，分析速度快，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，而且構(gòu)建敏感電極的方法靈活，體系容易集成化、微型化，而被人們廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、發(fā)酵工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。目前，已成為21世紀(jì)高新技術(shù)的研究新熱點(diǎn)，具有重要的戰(zhàn)略意義。

高效固定生物敏感元件（酶、抗原或抗體）是構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵，是決定傳感器性能優(yōu)異的主要因素。因此，制備出生物相容性良好的載體材料構(gòu)建高靈敏傳感界面，是電化學(xué)生物傳感器的研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)課題。

目前，載體材料的研究開(kāi)發(fā)主要集中在納米材料方面，包括納米粒子、納米管、納米線及其復(fù)合納米材料，如：金納米粒子、碳納米管、銀納米線等。將納米材料引入電化學(xué)生物傳感器傳感界面的構(gòu)建，一方面能有效增加電極的比表面積，提高酶或免疫蛋白分子的負(fù)載量；另一方面納米材料具有良好的電子傳遞性能，可以增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性，從而提高傳感器的靈敏度和響應(yīng)性能。但是許多納米材料與生物分子相容性差，不能有效負(fù)載酶或免疫分子并保持其生物活性，這嚴(yán)重影響了該材料在電化學(xué)生物傳感器中的實(shí)際應(yīng)用。

磁性納米粒子由于其獨(dú)特的磁學(xué)特性和巨大的比表面積，使其成為負(fù)載生物分子的理想材料。然而,未經(jīng)表面修飾的磁性納米粒子易被氧化而失去磁性。天然蛋白分子，如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、血紅蛋白（HGB），對(duì)生物分子具有極高的親和性,而且安全無(wú)毒、可生物降解。將其修飾于磁性納米粒子不僅能夠保護(hù)其不被環(huán)境侵蝕，還能為生物分子提供良好的生物相容性環(huán)境。金納米（AuNPs）由于具有比表面積大、生物相容性好、電子傳輸性能優(yōu)異等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。為了提高傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度，本發(fā)明制備殼層含有金的磁性復(fù)合納米粒子，并將其作為生物分子的載體，構(gòu)建出電化學(xué)生物傳感界面。該粒子不僅具有單一納米粒子效應(yīng)，還具有復(fù)合納米粒子協(xié)同作用的多功能效應(yīng)，既能為生物分子提供良好的生物相容性環(huán)境，同時(shí)又能提高電極的電子傳輸效率，從而增強(qiáng)傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供磁性復(fù)合納米材料、電化學(xué)生物傳感器及制備、構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有傳感器靈敏度低、載體材料與酶、抗原或抗體間相容性差的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，包括步驟：

A、將蛋白分子加入到鐵磁性納米粒子中，攪拌20~24小時(shí)得到復(fù)合物；

B、將金屬納米粒子修飾在上述復(fù)合物的殼層，獲得磁性復(fù)合納米材料。

所述的磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，所述鐵磁性納米粒子按如下方法得到：將沉淀劑加入到鐵鹽中，于80~90℃下攪拌0.5~2小時(shí)，形成鐵磁性納米粒子。

所述的磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，所述鐵鹽包括二價(jià)鐵鹽和二價(jià)鐵鹽，所述二價(jià)鐵鹽為二價(jià)鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物中的一種或多種組合，所述二價(jià)鐵鹽為三價(jià)鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物中的一種或多種組合。

所述的磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，所述金屬納米粒子為金納米粒子。

所述的磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，所述的蛋白分子可以為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血紅蛋白、乳清蛋白、酪蛋白、谷蛋白、免疫球蛋白、多肽、殼聚糖、天冬氨酸、半胱氨酸中的一種。

所述的磁性復(fù)合納米材料的制備方法，其中，所述步驟B中，加入蛋白分子之后，調(diào)節(jié)pH至4.0~9.0。

一種磁性復(fù)合納米材料，其中，采用如上任一項(xiàng)所述的制備方法制成。

一種電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建方法，其中，將如上所述的磁性復(fù)合納米材料均勻滴涂于基底電極，構(gòu)建出電化學(xué)生物傳感器。

一種電化學(xué)生物傳感器，其中，采用如上所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。

所述的電化學(xué)生物傳感器，其中，所述電化學(xué)生物傳感器為電化學(xué)酶?jìng)鞲衅骰螂娀瘜W(xué)免疫傳感器。

有益效果：通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得的磁性復(fù)合納米材料不僅具有巨大的比表面積和優(yōu)異的電子傳輸性能，而且能為酶或免疫分子提供良好的生物相容性環(huán)境，采用該磁性復(fù)合納米材料制備的電化學(xué)生物傳感器線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中磁性復(fù)合納米粒子的制備原理圖。

圖2為本發(fā)明中蛋白分子包覆Fe₃O₄磁性納米粒子的TEM圖。

圖3為本發(fā)明中殼層含有金的磁性復(fù)合納米粒子的TEM圖。

圖4為本發(fā)明連續(xù)滴加相同濃度葡萄糖對(duì)實(shí)施例1的酶電極進(jìn)行測(cè)試的響應(yīng)圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中酶電極的電流-濃度擬合曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供磁性復(fù)合納米材料、電化學(xué)生物傳感器及制備、構(gòu)建方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所提供的一種磁性復(fù)合納米材料的制備方法較佳實(shí)施例，其包括步驟：

S1、將蛋白分子加入到鐵磁性納米粒子中，攪拌20~24小時(shí)得到復(fù)合物；

S2、將金屬納米粒子修飾在上述復(fù)合物的殼層，獲得磁性復(fù)合納米材料。

如圖1所示，本發(fā)明首先將蛋白分子對(duì)鐵磁性納米粒子（圖中示為磁性納米粒子）進(jìn)行修飾，再用金屬納米粒子修飾復(fù)合物的殼層，從而得到磁性復(fù)合納米材料。

在所述步驟S1中，所述鐵磁性納米粒子按如下方法得到：將沉淀劑加入到鐵鹽中，于80~90℃下攪拌0.5~2小時(shí)，形成鐵磁性納米粒子。

所述鐵鹽包括二價(jià)鐵鹽和二價(jià)鐵鹽，所述二價(jià)鐵鹽為二價(jià)鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物中的一種或多種組合，所述二價(jià)鐵鹽為三價(jià)鐵的硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物中的一種或多種組合。

優(yōu)選的，所述二價(jià)鐵鹽和三價(jià)鐵鹽的摩爾比例優(yōu)選為1:2~2:3。

所使用的沉淀劑優(yōu)選為氨水或氫氧化鈉溶液。

在反應(yīng)結(jié)束后，可通過(guò)磁分離的方式分離出鐵磁性納米粒子，并用乙醇和水洗滌。

本發(fā)明的鐵磁性納米粒子為共沉淀法制備，還可以是其他方法制備的鐵磁性納米粒子。其他制備方法可以是球磨法、水解法、氧化法、乳化法、水熱法、電化學(xué)發(fā)、溶膠-凝膠法；本發(fā)明的鐵磁性納米粒子優(yōu)選為Fe₃O₄磁性納米粒子，還可是其他鐵磁性納米粒子，例如γ-Fe₂O₃、CoFe₂O₄、NiFe₂O₄ 、MnFe₂O₄以及Fe-N化合物。

在所述步驟S1中，所述的蛋白分子可以為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白（HSA）、血紅蛋白（HGB）、乳清蛋白（Alb）、酪蛋白(CS)、谷蛋白（Glu）、免疫球蛋白、多肽、殼聚糖、天冬氨酸、半胱氨酸中的一種。

至于所述蛋白分子的加入量，以牛血清白蛋白為例，按質(zhì)量比，鐵磁性納米粒子：牛血清白蛋白為16-55:1，優(yōu)選為1-18:1。

另外，在加入蛋白分子之后，調(diào)至最佳pH值，例如調(diào)節(jié)pH至4.0~9.0，優(yōu)選為4.6~4.7。反應(yīng)結(jié)束后，以磁分離的方式分離出蛋白分子修飾（包裹）的Fe₃O₄磁性納米粒子（即復(fù)合物），并用乙醇和水洗滌，即蛋白分子包覆Fe₃O₄磁性納米粒子的TEM圖如圖2所示。

在所述步驟S2中，采用原位法或非原位法將金屬納米粒子修飾在上述復(fù)合物的殼層。原位法為利用蛋白與氯金酸離子之間的靜電或絡(luò)合作用，先將氯金酸離子均勻分散在磁性復(fù)合納米粒子表面，再用還原劑將氯金酸還原成金納米，形成殼層含有金屬納米的磁性復(fù)合納米材料。非原位法為先合成金屬納米，再利用蛋白分子表面的胺基、巰基與金屬納米之間的Au-S鍵和Au-N（以金為例），將金屬納米修飾到復(fù)合物的殼層上，形成殼層含有金屬納米的磁性復(fù)合納米粒子上。所述金屬納米粒子優(yōu)選為金納米粒子，即所述復(fù)合物為殼層含有金的磁性復(fù)合納米粒子，殼層含有金的磁性復(fù)合納米粒子的TEM圖如圖3所示。

反應(yīng)結(jié)束后，磁分離出殼層含有金的磁性復(fù)合納米粒子，并用乙醇和水洗滌。

本發(fā)明還提供一種磁性復(fù)合納米材料較佳實(shí)施例，其采用如上所述的制備方法制成。

本發(fā)明還提供一種電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建方法較佳實(shí)施例，其中，將如上所述的磁性復(fù)合納米材料均勻滴涂于基底電極，構(gòu)建出電化學(xué)生物傳感器。所述的基底電極為玻碳電極、鉑電極、金電極、碳糊電極、銦錫氧化物、熱解石墨電極或磁性電極。所述的基底電極已經(jīng)經(jīng)過(guò)清洗處理，并且已拋光至鏡面，實(shí)質(zhì)是構(gòu)建出電化學(xué)生物傳感界面。

本發(fā)明還提供一種電化學(xué)生物傳感器較佳實(shí)施例，其采用如上所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。所述的電化學(xué)生物傳感器為電化學(xué)酶?jìng)鞲衅骰螂娀瘜W(xué)免疫傳感器。

下面通過(guò)實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明的突出特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，僅在于說(shuō)明本發(fā)明而決不限制本發(fā)明。

以下實(shí)施例中，使用的基底電極在滴涂前的處理方法：將基底電極依次經(jīng)過(guò)1.0，0.3 和0.05μm 的A1₂O₃ 拋光后用蒸餾水沖洗干凈，再分別用乙醇和超純水超聲洗滌5 min，N₂吹干以待備用。

以下實(shí)施例中，采用的測(cè)試系統(tǒng)為三電極體系：工作電極為修飾電極，輔助電極為鉑絲，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl)，所有的工作電極均相對(duì)于Ag/AgCl (飽和KCl)。

以下實(shí)施例中，使用的2 nm金膠的制備方法：將1.0 mL 1% HAuCl₄·3H₂O加入90 mL超純水中，攪拌1 min后，加入2 mL 38.8 mM檸檬酸鈉，攪拌1 min，最后快速加入1 mL 0.075% NaBH₄，攪拌5 min既得橙紅色金膠。

實(shí)施例1

取0.7 g FeSO₄·7H₂O溶于80 mL 超純水中，在氮?dú)鈿夥障?，加?0 mL 2.0 M KNO₃和10 mL 1.0 M NaOH溶液后，在90 ℃的環(huán)境中高速攪拌2 h，F(xiàn)e₃O₄磁性納米粒子逐漸生成。取110 mg Fe₃O₄和7.5 mg BSA于4 mL pH4.64的PBS溶液中搖床振蕩20 h后，取1 mL Fe₃O₄/BSA復(fù)合納米粒子（復(fù)合物），加入3.0 mL 1% HAuCl₄·3H₂O攪拌12 h，逐滴加入過(guò)量新制的NaBH₄ (0.01 M)，攪拌3 h，外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，并將所得固相用超純水和乙醇各洗3遍，既得Fe₃O₄/BSA/Au復(fù)合納米粒子（磁性復(fù)合納米材料）。最后將葡萄糖氧化酶GOx修飾于該粒子上，以Pt為基底電極，制備出含酶型葡萄糖傳感器，并在綜合電化學(xué)分析儀（Solartron SI 1260）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，其結(jié)果如圖4和圖5所示。該傳感器對(duì)葡萄糖的線性響應(yīng)范圍為0.25~7.0 mM，響應(yīng)時(shí)間僅為0.8s，靈敏度高達(dá)115.3 μA mM^-1? cm^-2。

實(shí)施例2

在氮?dú)鈼l件下，將0.1 M FeCl₂和0.2 M FeCl₃的混合液滴加到1.5 M NaOH中，于80℃下高速攪拌2h， Fe₃O₄磁性納米粒子逐漸生成。取110 mg Fe₃O₄和7.5 mg BSA于5 mL pH4.7的PBS溶液中搖床振蕩20 h后，取1 mL Fe₃O₄/BSA復(fù)合納米粒子（復(fù)合物），加入過(guò)量金納米(2nm)，攪拌至吸附飽和后，外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，并將所得固相用超純水和乙醇各洗3遍，既得Fe₃O₄/BSA/Au復(fù)合納米粒子（磁性復(fù)合納米材料）。最后將葡萄糖氧化酶GOx修飾于該粒子上，以Pt為基底電極，制備出含酶型葡萄糖傳感器，并在綜合電化學(xué)分析儀（Solartron SI 1260）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。該傳感器對(duì)葡萄糖的線性響應(yīng)范圍為0.25~5.5 mM，響應(yīng)時(shí)間僅為2.4s，靈敏度高達(dá)68.0 μA mM^-1? cm^-2。

實(shí)施例3

取0.7 g FeSO₄·7H₂O溶于80 mL 超純水中，在氮?dú)鈿夥障?，加?0 mL 2.0 M KNO₃和10 mL 1.0 M NaOH溶液后，在90 ℃的環(huán)境中高速攪拌1 h，F(xiàn)e₃O₄磁性納米粒子逐漸生成。取110 mg Fe₃O₄和7.5 mg BSA于4 mL pH4.64的PBS溶液中搖床振蕩20 h后，取1 mL Fe₃O₄/BSA復(fù)合納米粒子（復(fù)合物），加入3.0 mL 1% HAuCl₄·3H₂O攪拌12 h，逐滴加入過(guò)量新制的NaBH₄，攪拌3 h后，向該混合液中加入適量二茂鐵巰基(FS)，均勻混合3h后，外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，并將所得固相用超純水和乙醇各洗3遍，既得Fe₃O₄/BSA/Au/FS復(fù)合納米粒子（磁性復(fù)合納米材料），并將其修飾于玻碳電極上，通過(guò)金納米吸附癌胚抗原單克隆抗體(anti-CEA)，用BSA封閉金納米上剩余的活性位點(diǎn)后，以癌胚抗原(CEA)作為模型腫瘤標(biāo)志物，構(gòu)建出非標(biāo)記型免疫傳感器，并在綜合電化學(xué)分析儀（CHI 600B型）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。研究結(jié)果表明，該傳感器在0~100 ng/mL CEA濃度范圍內(nèi)獲得優(yōu)異的線性響應(yīng)，檢測(cè)限僅為0.98ng/mL，將制備好的免疫電極于4 ℃下懸置于緩沖液上方，隔3~4天對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，24天后，免疫電極響應(yīng)電流為最初值的93%。

實(shí)施例4

在氮?dú)鈿夥障?，?.1M FeCl₂·4H₂O和0.2M FeCl₃·6H₂O混勻后，逐滴加入過(guò)量的25%濃氨水，在90 ℃下高速攪拌1 h，F(xiàn)e₃O₄磁性納米粒子逐漸生成。取110 mg Fe₃O₄和7.5 mg BSA于4 mL pH4.7的PBS溶液中搖床振蕩20 h后，既得Fe₃O₄/BSA納米粒子（復(fù)合物）。取25 mg巰基乙胺于5mL超純水中，調(diào)pH 至6.5后，逐滴加入90 mL金納米,待溶液由透明變深紫色既得胺基化的金膠。將70 mg二茂鐵甲醛（Fc）溶于10 mL甲醇溶液，并逐滴加入95 mL胺基化的金膠中，反應(yīng)2 h后加入硼氫化鈉繼續(xù)反應(yīng)12 h，既得Au/NH/Fc復(fù)合物，并將該混合液的pH調(diào)至4.64后，加入1 mL Fe₃O₄/BSA，于搖床下振蕩3 h沉淀物會(huì)被完全吸附，再加入過(guò)量金納米(2nm)，攪拌至吸附飽和后，外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，并將所得固相用超純水和乙醇各洗3遍，既得 Fe₃O₄/BSA/Au/Fc復(fù)合納米粒子（磁性復(fù)合納米材料）。將該粒子修飾于處理好的玻碳電極上，通過(guò)金納米吸附癌胚抗原單克隆抗體(anti-CEA)，用BSA封閉金納米上剩余的活性位點(diǎn)后，以癌胚抗原(CEA)作為模型腫瘤標(biāo)志物，構(gòu)建出非標(biāo)記型免疫傳感器，并在綜合電化學(xué)分析儀（CHI 600B型）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。研究結(jié)果表明，該傳感器在0~120 ng/mL CEA濃度范圍內(nèi)獲得優(yōu)異的線性響應(yīng)，檢測(cè)限僅為0.47ng/mL，將制備好的免疫電極于4 ℃下懸置于緩沖液上方，隔3~4天對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，24天后，免疫電極響應(yīng)電流為最初值的90%。

實(shí)施例5

在氮?dú)鈿夥障?，?.1M FeCl₂·4H₂O和0.2M FeCl₃·6H₂O混勻后，逐滴加入1.0 M NaOH溶液，在90 ℃下高速攪拌1 h，F(xiàn)e₃O₄磁性納米粒子逐漸生成。取110 mg Fe₃O₄和7.5 mg BSA于5 mL pH4.64的PBS溶液中搖床振蕩24 h后，取1 mL Fe₃O₄/BSA復(fù)合納米粒子（復(fù)合物），加入過(guò)量金納米(2nm)，攪拌至吸附飽和后，外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，并將所得固相用超純水和乙醇各洗3遍，既得Fe₃O₄/BSA/Au復(fù)合納米粒子（磁性復(fù)合納米材料），并將其修飾于玻碳電極上，采用電化學(xué)掃描法將電子媒介體高氯酸?吡啶合鈷固定于工作電極表面后，通過(guò)靜電作用進(jìn)一步吸附金納米粒子(2nm)，之后吸附癌胚抗原單克隆抗體(anti-CEA)，并用BSA 封閉多余活性位點(diǎn)后，以癌胚抗原(CEA)作為模型腫瘤標(biāo)志物，構(gòu)建出非標(biāo)記型免疫傳感器，并在綜合電化學(xué)分析儀（CHI 600B型）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。研究結(jié)果表明，該傳感器在0~100 ng/mL CEA濃度范圍內(nèi)獲得優(yōu)異的線性響應(yīng)，檢測(cè)限僅為0.93ng/mL，將制備好的免疫電極于4 ℃下懸置于緩沖液上方，隔3~4天對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，50天后，免疫電極響應(yīng)電流為最初值的95.75%。

綜上所述，通過(guò)本發(fā)明的制備方法獲得的磁性復(fù)合納米材料不僅具有巨大的比表面積和優(yōu)異的電子傳輸性能，而且能為酶或免疫分子提供良好的生物相容性環(huán)境，采用該磁性復(fù)合納米材料制備的電化學(xué)生物傳感器線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。