本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器及其制備方法?？梢杂糜跐O業(yè)生產(chǎn)中孔雀石綠的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

孔雀石綠(Malachite green,簡稱MG)，屬三苯甲烷類染料，其代謝為無色孔雀石綠，長期以來，由于孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有良好的抗真菌病，水產(chǎn)品保鮮以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，成為許多養(yǎng)殖戶青睞的“漁藥”來使用，但這兩種物質(zhì)均具有高毒素、高殘留和高致畸、致突變等副作用，已成為重大的食品安全隱患。目前，孔雀石綠被我國列為禁用漁藥，現(xiàn)有的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法等。這些方法有操作繁瑣、儀器價(jià)格昂貴，需要專業(yè)的技術(shù)人員，而且不適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模的檢測(cè)等缺點(diǎn)。而現(xiàn)場(chǎng)常使用商品化酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測(cè)孔雀石綠，但容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，我國急需建立一種準(zhǔn)確、快速、便攜、簡單操作的檢測(cè)孔雀石綠的方法

近年來，適配體(aptamer)作為識(shí)別元件特異性識(shí)別小分子的生物傳感器成為研究熱點(diǎn)，主要是其識(shí)別元件較穩(wěn)定，受環(huán)境干擾和限制比較少，易于合成等方面的優(yōu)勢(shì)。目前，已有兩個(gè)專利公開了兩種適配體型檢測(cè)孔雀石綠的方法。其中，公開專利(申請(qǐng)?zhí)枮?00710070381.0)一種利用適配子快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的方法，利用特定序列的單鏈DNA為適配體，采用酶聯(lián)顯色法檢測(cè)，但其酶聯(lián)法易產(chǎn)生結(jié)果假陽性的問題沒有解決。另一個(gè)，公開專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01410008020.3)一種通過電化學(xué)適配體傳感器來檢測(cè)孔雀石綠的方法，采用特定序列RNA為識(shí)別元件，通過適配體和目標(biāo)物的結(jié)合作用把目標(biāo)物結(jié)合到電極表面，然后在結(jié)合上目標(biāo)物的抗體，構(gòu)成夾心結(jié)構(gòu)；電化學(xué)方法避免了一定程度在檢測(cè)中的假陽性問題，但是該專利中抗體制備需要?jiǎng)游镄詫?shí)驗(yàn)時(shí)間長，也比較困難；更主要的RNA適配體價(jià)格昂貴、不穩(wěn)定而且標(biāo)記相當(dāng)困難，這也限制了RNA適配體在檢測(cè)孔雀石綠方面的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，解決了檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽性的問題，并大幅降低了成本。針對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)的不足，提供一種快速、簡單、準(zhǔn)確、成本低可用于水溶液中孔雀石綠檢測(cè)的適配體型電化學(xué)生物傳感器及其制備方法。

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器，包括識(shí)別元件和換能器；識(shí)別元件是單鏈DNA適配體，序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個(gè)堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)(MB)作為信標(biāo)分子；換能器為常用的電化學(xué)型換能器，工作電極為修飾有上述孔雀石綠單鏈DNA適配體的金電極，對(duì)電極為Pt，參比電極為Ag/AgCl；檢測(cè)底液為磷酸鹽緩沖溶液。

其檢測(cè)原理是：加入孔雀石綠靶分子之前信標(biāo)分子MB距離電極表面較遠(yuǎn)，電子轉(zhuǎn)移較慢，MB電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)較小，加入孔雀石綠后與單鏈DNA適配體相互作用形成莖環(huán)，MB與電極表面之間的距離被拉近，其電化學(xué)信號(hào)增加，通過電化學(xué)信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)孔雀石綠的檢測(cè)。

圖1給出單鏈DNA適配體和孔雀石綠相互作用的紫外‐可見光譜圖。從圖1中可以看出，在波長范圍為220～320nm區(qū)間，單鏈DNA適配體本身在260nm處有一個(gè)吸收峰。當(dāng)加入孔雀石綠靶分子后，該吸收峰降低，說明兩種存在著相互作用。

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器的制備方法，具體步驟及參數(shù)如下：

1、金電極的拋光及活化處理：將金電極在拋光布上用氧化鋁粉末打磨，用乙醇和超純水分別超聲清洗，然后在硫酸溶液中電化學(xué)掃描活化，超純水沖洗后，用氮?dú)獯蹈纱茫?/p>

2、適配體溶液的配制：將單鏈DNA適配體冷凍液，先渦旋1～3min，使其能夠均勻分散，用超純水配制濃度為3.3～10μmolL^-1的適配體溶液；

單鏈DNA適配體：序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個(gè)堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)(MB)作為信標(biāo)分子；

3、修飾電極的制備：取5～10μL步驟2中配制的適配體溶液，滴在步驟1活化后的金電極表面，將電極置于4℃的冰箱中組裝12～16h，用蒸餾水洗去非特異性吸附的適配體，然后用于檢測(cè)，不使用時(shí)，在冰箱4℃下保存。

上述傳感器建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟為：

1、以上述修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt為對(duì)電極，磷酸緩沖液為檢測(cè)底液，采用差分脈沖伏安法(DPV)來檢測(cè)，掃描電位范圍為0.2～-0.5V，振幅為0.05V，以MB作為信標(biāo)分子，記錄其DPV譜圖，得到MB的還原峰電流值，作為空白時(shí)的電流響應(yīng)I₀。

磷酸緩沖液的pH值為6.0～8.0，濃度為0.05～0.1molL^-1。

2、將修飾電極依次浸入含有孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)底液中，在濃度為1×10^‐1～1×10⁴pg L^-1的各個(gè)數(shù)量級(jí)分別選取1-2個(gè)測(cè)試點(diǎn)，各濃度在室溫下孵育100～600s，接下來記錄工作電極的DPV曲線，其測(cè)試條件同步驟1，得到在不同濃度孔雀石綠的MB的DPV譜圖以及相應(yīng)的還原峰電流值I_p，并計(jì)算不同濃度的孔雀石綠相對(duì)于初始適配體傳感器峰電流的相對(duì)變化差值ΔI＝I_p‐I₀。

3、以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品水溶液濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可應(yīng)用于未知水樣中孔雀石綠的檢測(cè)。

本發(fā)明的效果為，利用本發(fā)明所述的孔雀石綠適配體電化學(xué)生物傳感器其線性范圍可跨越為5個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限最低可達(dá)0.08pg L^‐1，比目前所報(bào)道的孔雀石綠的檢測(cè)限都要低。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，解決了現(xiàn)有的檢測(cè)孔雀石綠的檢測(cè)成本高，檢測(cè)方案復(fù)雜，準(zhǔn)確度不高等缺點(diǎn)，提供了一種檢測(cè)快速，成本低，操作簡便、易于便攜的孔雀石綠適配體電化學(xué)生物傳感器及其制備方法。該孔雀石綠適配體價(jià)格經(jīng)濟(jì)、易于標(biāo)記，傳感器的制備程序和檢測(cè)方法簡單，具有線性范圍寬和檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于水體中現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確、快速和高靈敏地檢測(cè)孔雀石綠。

附圖說明

圖1為孔雀石綠適配體aptamer及其與靶分子孔雀石綠結(jié)合aptamer‐MG后的紫外‐可見吸收光譜圖。

圖2為實(shí)施例1中孔雀石綠適配體電化學(xué)生物傳感器在不同濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液中的差分脈沖伏安譜圖。

圖3為實(shí)施例1中裸金電極(Au)，修飾適配體后的金電極(aptamer‐Au)以及該修飾電極結(jié)合孔雀石綠后的電極(MG‐aptamer‐Au)在5mmol L^‐1的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安譜圖。

圖4實(shí)施例1中生物傳感器對(duì)孔雀石綠檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器，包括識(shí)別元件和換能器；識(shí)別元件是單鏈DNA適配體，序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個(gè)堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)(MB)作為信標(biāo)分子；換能器為常用的電化學(xué)型換能器，工作電極為修飾有上述孔雀石綠單鏈DNA適配體的金電極，對(duì)電極為Pt，參比電極為Ag/AgCl；檢測(cè)底液為磷酸鹽緩沖溶液。

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金電極在拋光布上用0.05μm的氧化鋁粉末打磨2min，用乙醇和超純水分別超聲清洗三次，在室溫25℃下，用氮?dú)獯蹈?；?molL^-1硫酸活化，通過循環(huán)伏安法，掃速為0.1Vs^-1，在電位1.55～-0.1V vs.Ag/AgCl電位范圍掃描20圈。

(2)將適配體冷凍液，先渦旋2min，使其能夠均勻分散，用超純水配制濃度為5μmolL^-1的適配體溶液。

(3)取8μL步驟(2)中配制的適配體水溶液，滴在步驟(1)活化后的金電極表面，將電極置于4℃的冰箱中組裝16h，用蒸餾水洗去非特異性吸附的適配體，然后用于檢測(cè)，不使用時(shí)，在冰箱4℃下保存。

(4)步驟(3)制備的修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt為對(duì)電極，pH值為7.0、濃度為0.05molL^-1的磷酸緩沖液為檢測(cè)底液，采用差分脈沖伏安法(DPV)來檢測(cè)，掃描電位范圍為0.2～-0.5V，振幅為0.05V，以MB作為信標(biāo)分子，記錄其DPV譜圖，得到MB的還原峰電流值，作為空白時(shí)的電流響應(yīng)I₀。

(5)將上述修飾電極依次浸入在含有濃度為1×10^-1～1×10⁴pgL^-1的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)底液中，各濃度在室溫下孵育，300s，接下來記錄工作電極的DPV曲線，其測(cè)試條件同步驟(4)，可得到在不同濃度孔雀石綠的DPV譜圖如圖2，并記錄MB相應(yīng)的還原峰電流值I_p,計(jì)算相對(duì)于初始適配體傳感器峰電流的相對(duì)變化差值即ΔI＝I_p-I₀。

電極的修飾過程及對(duì)孔雀石綠的識(shí)別結(jié)合過程，可以通過電極界面的電子轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。圖3中給出了實(shí)施例1中裸金電極(Au)，修飾適配體后的金電極(aptamer‐Au)以及該修飾電極結(jié)合孔雀石綠后的電極(MG‐aptamer‐Au)在5mmol L^‐1的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安譜圖。掃描速度為，0.1V s^‐1，底液中電解質(zhì)為0.1mol L^‐1KCl。鐵氰化鉀在裸金電極有一對(duì)可逆的氧化還原峰，當(dāng)金電極修飾適配體后，由于適配體的阻礙，鐵氰化鉀的氧化還原峰電流都明顯降低，說明了適配體已成功修飾到裸金電極表面。當(dāng)進(jìn)一步結(jié)合孔雀石綠時(shí)，適配體由最初的伸展?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變成莖環(huán)狀，從而進(jìn)一步阻礙了鐵氰化鉀在電極表面的傳遞，因此鐵氰化鉀的氧化還原峰電流又進(jìn)一步降低。

(6)以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品水溶液濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4。在1×10^‐1～1×10⁴pg L^-1濃度范圍內(nèi)，△I與孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R²＝0.9916)，線性方程為y＝0.314+0.07x，檢測(cè)限為0.08pg L^-1。

實(shí)施例2

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器，包括識(shí)別元件和換能器；識(shí)別元件是單鏈DNA適配體，序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個(gè)堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)(MB)作為信標(biāo)分子；換能器為常用的電化學(xué)型換能器，工作電極為修飾有上述孔雀石綠單鏈DNA適配體的金電極，對(duì)電極為Pt，參比電極為Ag/AgCl；檢測(cè)底液為磷酸鹽緩沖溶液。

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金電極在拋光布上用0.05μm的氧化鋁粉末打磨2min，用乙醇和超純水分別超聲清洗三次，在室溫25℃下，用氮?dú)獯蹈?；?molL^-1硫酸活化，通過循環(huán)伏安法，掃速為0.1Vs^-1，在電位1.55～-0.1V vs.Ag/AgCl電位范圍掃描20圈。

(2)將適配體冷凍液，先渦旋1min，使其能夠均勻分散，用超純水配制濃度為3.3μmolL^-1的適配體溶液。

(3)取5μL步驟(2)中配制的適配體水溶液，滴在步驟(1)活化后的金電極表面，將電極置于4℃的冰箱中組裝14h，用蒸餾水洗去非特異性吸附的適配體，然后用于檢測(cè)，不使用時(shí)，在冰箱4℃下保存。

(4)步驟(3)制備的修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt為對(duì)電極，pH值為6.0、濃度為0.05molL^-1的磷酸緩沖液為檢測(cè)底液，采用差分脈沖伏安法(DPV)來檢測(cè)，掃描電位范圍為0.2～-0.5V，振幅為0.05V，以MB作為信標(biāo)分子，記錄其DPV譜圖，得到MB的還原峰電流值，作為空白時(shí)的電流響應(yīng)I₀。

(5)將上述修飾電極依次浸入在含有濃度為1×10^-1～1×10⁴pg L^-1的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)底液中，各濃度在室溫下孵育100s，接下來記錄工作電極的DPV曲線，其測(cè)試條件同步驟(4)，可得到在不同濃度孔雀石綠的DPV譜圖，并記錄MB相應(yīng)的還原峰電流值I_p,計(jì)算相對(duì)于初始適配體傳感器峰電流的相對(duì)變化差值即ΔI＝I_p-I₀。

(6)以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品水溶液濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)施例3

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器，包括識(shí)別元件和換能器；識(shí)別元件是單鏈DNA適配體，序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個(gè)堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)(MB)作為信標(biāo)分子；換能器為常用的電化學(xué)型換能器，工作電極為修飾有上述孔雀石綠單鏈DNA適配體的金電極，對(duì)電極為Pt，參比電極為Ag/AgCl；檢測(cè)底液為磷酸鹽緩沖溶液。

一種檢測(cè)孔雀石綠的適配體電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金電極在拋光布上用0.05μm的氧化鋁粉末打磨2min，用乙醇和超純水分別超聲清洗三次，在室溫25℃下，用氮?dú)獯蹈?；?molL^-1硫酸活化，通過循環(huán)伏安法，掃速為0.1Vs^-1，在電位1.55～-0.1V vs.Ag/AgCl電位范圍掃描20圈。

(2)將適配體冷凍液，先渦旋3min，使其能夠均勻分散，用超純水配制濃度為10μmolL^-1的適配體溶液。

(3)取10μL步驟(2)中配制的適配體水溶液，滴在步驟(1)活化后的金電極表面，將電極置于4℃的冰箱中組裝12h，用蒸餾水洗去非特異性吸附的適配體，然后用于檢測(cè)，不使用時(shí)，在冰箱4℃下保存。

(4)步驟(3)制備的修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt為對(duì)電極，pH值為8.0、濃度為0.05molL^-1的磷酸緩沖液為檢測(cè)底液，采用差分脈沖伏安法(DPV)來檢測(cè)，掃描電位范圍為0.6～-0.5V，振幅為0.05V，以MB作為信標(biāo)分子，記錄其DPV譜圖，得到MB的還原峰電流值，作為空白時(shí)的電流響應(yīng)I₀。

(5)將上述修飾電極依次浸入在含有濃度為1×10^-1～1×10⁴pg L^-1的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)底液中，各濃度在室溫下孵育600s，接下來記錄工作電極的DPV曲線，其測(cè)試條件同步驟(4)，可得到在不同濃度孔雀石綠的DPV譜圖，并記錄MB相應(yīng)的還原峰電流值I_p,計(jì)算相對(duì)于初始適配體傳感器峰電流的相對(duì)變化差值即ΔI＝I_p-I₀。

(6)以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品水溶液濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。