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一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:12119403閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1. 一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條,包括樣品墊(1)、金標墊 (2)、NC膜(3)、檢測線T線(4)、質(zhì)控線C線(5)、吸水墊(6)和PVC底板(7),所述PVC底板(7)的上部貼合有NC膜(3),所述NC膜(3)上部兩端分別搭接有金標墊(2)和吸水墊(6),所述金標墊(2)上部搭接有樣品墊(1),所述檢測線T線(4) 設(shè)置在靠近樣品墊(1)的NC膜(3)表面上,所述質(zhì)控線C線(5) 設(shè)置在靠近吸水墊(6)的NC膜(3)上,其特征在于:

所述檢測線T線(4)上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液劃膜濃度為0.5-1.5μL/cm,所述用來進行劃膜的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液的濃度為0.5-1.5mg/mL;

所述質(zhì)控線C線(5)上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體,所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為0.5-1.5μL/cm,所述用來進行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為0.5-1.5mg/mL;

所述金標墊(2)上結(jié)合有馬鈴薯病毒膠體金標記物,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物溶液噴涂濃度為4-6μL/cm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條,其特征在于:馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設(shè)有卡殼(8),所述卡殼(8)上部表面與樣品墊(1)對應(yīng)的位置上設(shè)有加樣孔(9),所述卡殼(8)上部表面與所述NC膜(3)對應(yīng)的位置上設(shè)有觀察槽(10)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條,其特征在于:所述NC膜(3)與金標墊 (2)搭接的長度為1-2mm,所述NC膜(3)與吸水墊(6) 搭接的長度為2-3mm,所述金標墊 (2)與樣品墊(1) 搭接的長度為2-3mm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條,其特征在于:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物,可以是以下組合中的任意一種:

組合1:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVX羊抗兔抗體,包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVX兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVX膠體金標記物;

組合2:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYNTN羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYNTN兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVYNTN膠體金標記物;

組合3:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYo羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYo兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVYo膠體金標記物;

組合4:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PLRV羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PLRV兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PLRV膠體金標記物;

組合5:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVS羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVS兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVS膠體金標記物;

組合6:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVM羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVM兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVM膠體金標記物;

組合7:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVA羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVA兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVA膠體金標記物;

組合8:所述包被在質(zhì)控線C線(5)上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體,所述包被在檢測線T線(4)上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體,所述結(jié)合在金標墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是番茄黑環(huán)病毒膠體金標記物。

5.一種基于權(quán)利要求1所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法,包括如下步驟:

步驟1:金標墊(2)的制備:

1) 馬鈴薯病毒膠體金標記物的制備:

用膠體金溶液標記馬鈴薯病毒兔多克隆抗體,馬鈴薯病毒兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL;

復(fù)溶液配方:PH8.0-8.8,8-12%蔗糖,3-6%海藻糖,0.5-2%牛血清白蛋白,溶劑為0.1-0.2mol/L的 Tris-HcL溶液;

膠體金溶液的制備:取297-300 mL超純水于圓底燒瓶中,加入2-4 mL濃度為1-2%氯金酸溶液,混勻;將圓底燒瓶置于恒溫器中,加入干凈攪拌子,低速攪拌并加熱沸騰;一次性加入2-4mL、1-2%檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸;時刻觀察溶液顏色變化,由淺黃色→黑色→紫色→紫紅色,當變?yōu)榫萍t色時,繼續(xù)煮沸4-6min,停止加熱,冷卻至室溫;超純水做空白對照,掃描膠體金溶液在500-550nm 之間的吸收值,如果吸收峰值在515-525nm出現(xiàn),則制備的膠體金溶液合格;

馬鈴薯病毒膠體金標記物的制備工藝:取2支離心管,加入1-2mL 膠體金溶液,加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3,再加入4-6μL馬鈴薯病毒兔多克隆抗體,靜置25-35min,再加入80-120μL 封閉劑,靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ,棄上清,加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀,在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ,吸取上清液,保存?zhèn)溆茫?/p>

2) 金標墊(2)與馬鈴薯病毒膠體金標記物的結(jié)合:選用玻璃纖維膜作為金標墊的支撐材料,將步驟1)制備的馬鈴薯病毒膠體金標記物,用三維大平臺噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上,在玻璃纖維膜上噴涂馬鈴薯病毒膠體金標記物的最佳噴涂濃度為4-6μL/cm,將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中,干燥時間2-4h,取出,放入鋁箔袋中,180-230℃ 熱合封口,保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟2:NC膜(3)的制備:

檢測線T線(4)和質(zhì)控線C線(5)的制備:用緩沖液稀釋待包被馬鈴薯病毒兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度,用三維大平臺劃膜噴金儀將馬鈴薯病毒兔多隆抗體劃膜到距離金標墊1-2cm處NC膜上,以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜(3)上,構(gòu)成檢測線T線(4);用緩沖液稀釋待包被馬鈴薯病毒羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度,用三維大平臺劃膜噴金儀將馬鈴薯病毒羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜(3)上,以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜(3)上,構(gòu)成質(zhì)控線C線(5);檢測線T線(4)和質(zhì)控線C線(5)距離4-6mm;將劃有檢測線T線(4)和質(zhì)控線C線(5)的NC膜(3) 置于35-40℃條件下烘干,封裝備用;

緩沖液:緩沖液的作用是提供一定pH和離子強度使馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和馬鈴薯病毒羊抗兔抗體牢固包被于NC膜(3)上,緩沖液的pH值為7.0~7.4;

步驟3:樣品墊(1)的制備:

選用玻璃纖維膜做為制備樣品墊(1)的材料,玻璃纖維膜經(jīng)處理后方可使用;

玻璃纖維膜的處理步驟:戴手套,將玻璃纖維膜放入處理液中,完全浸泡,浸泡5-15min,后取出脫水3-5min,平置在篩網(wǎng)上,放入35-40℃干燥箱,烘干至濕度恒定在20-30%,將烘干后的玻璃纖維膜裝入鋁箔袋熱封保存;

處理液的配方:PH7.8-8.0磷酸緩沖液,0.5-1.5%S9表面活性劑溶液,0.4-0.5%吐溫20,0.5-1.5%牛血清白蛋白,0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液,溶劑為水;

步驟4:試紙條的組裝:

把步驟1 ~ 3所制作完成材料,根據(jù)PVC底板(7)的規(guī)格切割成一定的長度和寬度,粘貼PVC底板(7)上并安裝在卡殼(8)里;

試紙條的組裝步驟:

1)將NC膜(3)粘貼在PVC底板(7)上;

2)將金標墊(2)搭接在NC膜(3)一端的上方,搭接長度為1-2mm;

3)將吸水墊(6)搭接在NC膜(3)另一端的上方,搭接長度為2-3mm;

4)將樣品墊(1)搭接在金標墊(2)的上方,搭接長度為2-3mm;

5)在斬切機中將粘貼好的PVC底板(7)剪切成條;

6)剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋,密封后貼上標簽。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法,其特征在于:

在馬鈴薯病毒膠體金標記物制備方法步驟中,加入的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體可以是PVX兔多克隆抗體、PVYNTN兔多克隆抗體、PVYo兔多克隆抗體、PLRV兔多克隆抗體、PVS兔多克隆抗體、PVM兔多克隆抗體、PVA兔多克隆抗體或番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體中的一種;

如果在馬鈴薯病毒膠體金標記物制備方法步驟中,加入的是PVX兔多克隆抗體,可制備成PVX膠體金標記物;如果加入的是PVYNTN兔多克隆抗體,可制備成PVYNTN膠體金標記物;如果加入的是PVYo兔多克隆抗體,可制備成PVYo膠體金標記物;如果加入的是PLRV兔多克隆抗體,可制備成PLRV膠體金標記物;如果加入的是PVS兔多克隆抗體,可制備成PVS膠體金標記物;如果加入的是PVM兔多克隆抗體,可制備成PVM膠體金標記物;如果加入的是PVA兔多克隆抗體,可制備成PVA膠體金標記物;如果加入的是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體,可制備成番茄黑環(huán)病毒膠體金標記物;除了加入馬鈴薯病毒兔多克隆抗體種類不同外,其他制備工藝參數(shù)都一致。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法,其特征在于:

所述馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和馬鈴薯鈴薯病毒羊抗兔抗體的制備方法具體為:

馬鈴薯病毒兔多克隆抗體的制備:取1-2mL馬鈴薯病毒兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀馬鈴薯病毒抗體;接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心,沉淀馬鈴薯病毒抗體,然后用磷酸緩沖液溶解馬鈴薯病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨,即得馬鈴薯病毒兔多克隆抗體;

馬鈴薯病毒羊抗兔抗體的制備:取1-2mL馬鈴薯病毒羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀病毒;接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心,沉淀馬鈴薯病毒抗體,然后用磷酸緩沖液溶解馬鈴薯病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨,即得馬鈴薯病毒羊抗兔抗體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法,其特征在于:

所述馬鈴薯病毒羊抗兔抗體和馬鈴薯病毒兔多克隆抗體可以選擇以下組合中的任意一種組合進行制備;

組合1: PVX羊抗兔抗體,PVX兔多克隆抗體;

組合2: PVYo羊抗兔抗體, PVYo兔多克隆抗體;

組合3: PVYNTN羊抗兔抗體,PVYNTN兔多克隆抗體;

組合4: PLRV羊抗兔抗體,PLRV兔多克隆抗體;

組合5: PVS羊抗兔抗體, PVS兔多克隆抗體;

組合6: PVM羊抗兔抗體, PVM兔多克隆抗體

組合7: PVA羊抗兔抗體, PVA兔多克隆抗體;

組合8:番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體,番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法,其特征在于:步驟2:NC膜(3)的制備中:用來劃膜質(zhì)控線C線(5)的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體和用來劃膜檢測線T線(4)的馬鈴薯病毒兔多隆抗體可以選擇以下組合中的任意一種:

組合1: PVX羊抗兔抗體,PVX兔多克隆抗體;

組合2: PVYo羊抗兔抗體, PVYo兔多克隆抗體;

組合3: PVYNTN羊抗兔抗體,PVYNTN兔多克隆抗體;

組合4: PLRV羊抗兔抗體,PLRV兔多克隆抗體;

組合5: PVS羊抗兔抗體, PVS兔多克隆抗體;

組合6: PVM羊抗兔抗體, PVM兔多克隆抗體

組合7: PVA羊抗兔抗體, PVA兔多克隆抗體;

組合8:番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體,番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體。

10.一種馬鈴薯快速檢測試紙條的應(yīng)用,其特征在于:用根據(jù)權(quán)利要求1~ 4所述的快速檢測試紙條對待檢馬鈴薯樣品進行檢測,具體檢測步驟為:

(1) 樣品處理:取馬鈴薯葉片,按葉片重量g和緩沖液體積V的比為1:8-1:10的比例加入磷酸鹽緩沖液,研磨出綠色汁液,磷酸鹽緩沖液的PH為7.4-7.8;

(2) 把上述處理過的樣品滴加到馬鈴薯快速檢測試紙條的樣品墊上,靜置0.5~ 3分鐘,觀察檢測線T線和質(zhì)控線C線;

(3) 結(jié)果判讀:檢測線T線和質(zhì)控線C線均顯現(xiàn)紫紅色為陽性;檢測線T線不顯現(xiàn)紫紅色,質(zhì)控線C線顯現(xiàn)紫紅色,結(jié)果為陰性;檢測線T線和質(zhì)控線C線均不顯現(xiàn)紫紅色或其他現(xiàn)象,提示試紙條失效。

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