一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制作方法

文檔序號：12248323閱讀：458來源：國知局

本實用新型涉及利用免疫層析技術檢測植物病毒技術領域，具體涉及一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條。

背景技術：

馬鈴薯是我國應用價值較高的經濟作物，己被列為我國7大作物之一，也是中國西部最重要的作物品種和主要的支柱型產業(yè)，發(fā)展勢頭良好，但目前我國馬鈴薯單產卻遠遠低于發(fā)達國家，馬鈴薯病毒是造成馬鈴薯產量低、質量差的主要原因。在中國的醫(yī)學檢驗如早孕、乙肝、寄生蟲、性病的檢驗和動物疫病的檢驗如禽病診斷、家畜疫病、小鼠肝炎病毒、豬旋毛蟲病、犬病病毒的診斷中有免疫層析試紙條的應用；在煙草、南瓜、萵苣、黃瓜花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脈帶病毒、柑橘潰瘍病菌、葫蘆科病毒、萵苣叢枝植原體的檢測中已有免疫層析試紙條的應用，但在馬鈴薯作物中還沒有田間快速檢測試紙條的應用。

常規(guī)的檢測馬鈴薯病毒的技術是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法，該方法需要專門的技術人員在專門的實驗室利用專門的設備進行實驗，操作過程繁瑣，實驗時間長：1.5-2天。不能現場取樣，現場出結果。目前生產上普遍采用馬鈴薯脫毒種薯來防治病毒病的危害，為確保馬鈴薯原原種、原種的脫毒質量，建立快速、準確、靈敏、高效的馬鈴薯病毒類病毒檢測技術是馬鈴薯種薯生產的關鍵技術環(huán)節(jié)。

通過檢索發(fā)現如下與本專利相關的專利公開文獻：

1、公開號為CN 103757138B的專利公開了一種云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種病毒的檢測方法。本實用新型通過對云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種特異性混合抗體誘捕病樣中病毒，不必提取樣品總RNA進行隨機引物逆轉錄和特異性病毒引物復合PCR反應。本方法將快速、特異的免疫沉淀與靈敏的復合RT-PCR結合，同時設置健康馬鈴薯隨機引物cDNA產物相應病毒PCR特異片段陽性質粒作為陰、陽性對照，從而快速、準確、靈敏的應用于檢測田間馬鈴薯植株樣品、抗病毒材料及田間環(huán)境疑似侵染源等方面。

2、公開號為CN 103757138B的專利涉及兩步法雙重RT一PCR同步檢測馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒，三重RT一PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒的方法及檢測試劑盒，是專門針對馬鈴薯產業(yè)影響較大的5種馬鈴薯病毒而建立的一種同步檢測2或3種病毒的快速方法，檢測時間僅用4h，且靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定可靠。該方法克服了現有對馬鈴薯病毒病依據癥狀學的常規(guī)診斷方法誤判率較高、血清學方法難以檢測休眠馬鈴薯中的病毒及病毒含量較少的韌皮部病毒—馬鈴薯卷葉病毒等缺點;該方法適用于馬鈴薯種苗、種薯多種病毒病的早期診斷，對馬鈴薯種薯質量監(jiān)測和病毒病預防有著重要的作用。

通過對比，本專利申請與上述專利公開文獻存在本質的不同。

技術實現要素：

本實用新型所要解決的技術問題是為了克服現有方法的不足，將馬鈴薯病毒快速檢測試紙條應用到馬鈴薯病毒檢測中，可實現對樣品中馬鈴薯病毒高特異性、高靈敏度、高準確性、高穩(wěn)定性的檢測，快速檢測出馬鈴薯病毒病的發(fā)生情況，為馬鈴薯脫毒薯種薯級別的定級和馬鈴薯病毒的防控提供理論依據。

本實用新型的目的是通過以下技術方案實現的：

一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，包括樣品墊1、金標墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標墊2和吸水墊6，所述金標墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質控線C線5 設置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，所述質控線C線5上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，所述的金標墊2上結合有膠體金標記物。

而且，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應的位置上設有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應的位置上設有觀察槽10。

而且，所述NC膜3與金標墊 2搭接的長度為1-2mm，所述NC膜3與吸水墊6搭接的長度為2-3mm，所述金標墊 2與樣品墊1 搭接的長度為2-3mm。

而且，所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和包被結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物，可以是以下組合中的任意一種：

組合1：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVX羊抗兔抗體，包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVX兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVX膠體金標記物；

組合2：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVY^c羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVY^c兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVY^c膠體金標記物；

組合3：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVY^NTN羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVY^NTN兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVY^NTN膠體金標記物；

組合4：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVY^o羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVY^o兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVY^o膠體金標記物；

組合5：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PLRV羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PLRV兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PLRV膠體金標記物；

組合6：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVS羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVS兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVS膠體金標記物；

組合7：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVM羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVM兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVM膠體金標記物；

組合8：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVA羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVA兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是PVA膠體金標記物；

組合9：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是TMV羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是TMV兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是TMV膠體金標記物；

組合10：所述包被在質控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體，所述結合在金標墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標記物是番茄黑環(huán)病毒膠體金標記物。

本實用新型中：PVX代表馬鈴薯X病毒，PVY^c代表馬鈴薯Y病毒的C株系，PVY^NTN代表馬鈴薯Y病毒的NTN株系，PVY^o代表馬鈴薯Y病毒的O株系，PLRV代表馬鈴薯卷葉病毒，PVS代表馬鈴薯S病毒，PVM代表馬鈴薯M病毒，PVA代表馬鈴薯A病毒，TMV代表煙草花葉病毒。

本實用新型的檢測原理：選用膠體金標記馬鈴薯病毒兔多克隆抗體制得膠體金標記物，噴涂在金標墊上；在檢測線T線上包被能與目的物蛋白復合物發(fā)生免疫反應的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，在質控線C線上包被馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，作為指示線。當把待檢樣品加樣到樣品墊上后，樣品中馬鈴薯病毒蛋白與金標墊上的膠體金標記物形成免疫復合物，由于毛細管效應，該復合物向吸水墊方向泳動，此復合物與包被在檢測線T線上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體發(fā)生特異性免疫結合反應，形成膠體金標記物、抗原（抗原是指馬鈴薯病毒）、兔多克隆抗體三聯(lián)體復合物而被截留在檢測線T線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由于毛細管效應繼續(xù)泳動向前，膠體金標記物與包被在質控線C線上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體發(fā)生特異性的免疫反應被截留，逐漸富集在質控線C線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結合的物質繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線T線和質控線C線都出現紫紅色線的判為陽性結果；若樣品中不含有馬鈴薯病毒，膠體金標記物到達檢測線T線時，不與包被在檢測線T線上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體發(fā)生免疫反應，因此在檢測線T線處沒有出現顯色帶，而膠體金標記物繼續(xù)向前泳動與包被在質控線C線上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體發(fā)生特異的免疫反應而被截留，逐漸富集在質控線上形成紫紅色線，因此僅在質控上出現紫紅線判為陰性結果。檢測線T線和質控線C線均不顯現紫紅色線或出現其他現象，提示試紙條失效，檢測失敗。

本實用新型的有益效果：

（1）本實用新型首次將免疫層析技術應用于馬鈴薯病毒病檢測，實現了高特異性、高靈敏的檢測性能。

（1）本實用新型使用方便、適用性強：無需實驗室、不需要任何特殊儀器、無需專業(yè)人員操作培訓、田間地頭、馬鈴薯貯藏窖、海關等任何有馬鈴薯的地方即可測試，每個馬鈴薯種植者均會使用。

（2）本實用新型檢測時間短，僅需1—5分鐘即可得出檢測結果。

（3）本實用新型準確性高：該試紙條檢測馬鈴薯樣品的準確率與雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗法的準確率完全吻合，符合率達100%。

（4）本實用新型特異性強：馬鈴薯一種病毒的試紙條僅該種病毒陽性材料檢測線及質控線均出現明顯條帶，其他陽性材料僅質控線出現條帶，檢測線未出現條帶；馬鈴薯病毒的檢測試紙條，對健康植株和緩沖液對照的檢測結果，僅C線出現紫紅色，T線未出現紫紅色，結果是陰性，因此本試紙條具有特異性。

（5）本實用新型穩(wěn)定性強：從試紙條測試結果來看，將試紙條放在內放干燥劑的密封鋁箔袋中，37℃下保存長時間后顏色略減弱，其他不同溫度、不同時間的測試結果無明顯變化，說明在適當條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性。

（6）本實用新型檢測成本低；對溫度無特殊需求，無須冷凍，儲存運輸方便，室溫可保存24個月。

附圖說明

圖1本實用新型主視圖（未畫卡殼）；

圖2為圖1左視圖；

圖3本實用新型卡殼結構示意圖；

圖4中為陽性結果示意圖；

圖5中為陰性結果示意圖；

圖6中為試紙條失效示意圖。

圖中：1樣品墊，2金標墊，3NC膜，4檢測線T線，5質控線C線，6吸水墊，7PVC底板，8卡殼，9加樣孔，10觀察槽。

具體實施方式

下面結合實施例，對本實用新型作進一步詳細的描述，但本實用新型的實施方式不限于此，不能以下述實施例來限定本實用新型的保護范圍。

下述實施實例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，如圖1、圖2所示，一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，包括樣品墊1、金標墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標墊2和吸水墊6，所述金標墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質控線C線5 設置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有PVX兔多克隆抗體，所述質控線C線5上包被有PVX羊抗兔抗體，所述的金標墊2上結合有PVX膠體金標記物。

本實施例中，如圖3所示，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應的位置上設有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應的位置上設有觀察槽10。